王海燕， 孫良忠△， 吳金浪， 蔣小云， 莫 櫻， 童華娟

(中山大學 1附屬第一醫(yī)院兒科，2中山醫(yī)學院電鏡室,廣東 廣州 510080)

腎小球濾過屏障超微結(jié)構(gòu)改變與Alport綜合征蛋白尿的關(guān)系*

王海燕1， 孫良忠1△， 吳金浪2， 蔣小云1， 莫 櫻1， 童華娟1

(中山大學1附屬第一醫(yī)院兒科，2中山醫(yī)學院電鏡室,廣東 廣州 510080)

目的探討腎小球濾過屏障超微結(jié)構(gòu)改變與Alport綜合征(AS)蛋白尿發(fā)生的關(guān)系。方法AS患者35例，男24例，女11例，腎活檢的年齡為1.17～24歲。根據(jù)尿蛋白結(jié)果將患者分為2組：無/間歇性蛋白尿組(13例)和持續(xù)性蛋白尿組(22例)。測量AS腎小球基底膜(GBM)變薄、增厚和致密層撕裂分層的長度，計算其各占GBM總長度的百分比；根據(jù)平均足突寬度(FPW)= π/4×(∑基底膜長度/∑足突個數(shù))計算患者足突寬度。分析比較2組患者GBM變薄、增厚、致密層撕裂分層比例和平均FPW及其與AS蛋白尿的關(guān)系。結(jié)果持續(xù)性蛋白尿組GBM增厚、致密層撕裂分層比例和平均FPW較無/間歇蛋白尿組高(均P<0.05)。平均FPW與GBM增厚、致密層撕裂分層及腎活檢年齡均呈正相關(guān)(均P<0.01)。結(jié)論AS患者GBM病變程度越重，足突融合越嚴重，蛋白尿越嚴重,提示AS基底膜異常有可能通過影響足突及裂孔膜的結(jié)構(gòu)和功能導致蛋白尿發(fā)生。

Alport綜合征; 腎小球基底膜; 足細胞; 蛋白尿

Alport綜合征(Alport syndrome，AS)是一組以進行性腎炎、感音神經(jīng)性聽力損害和眼部病變?yōu)樘卣鞯呐R床綜合征[1]。AS是腎小球基底膜(glomerular basement membrane,GBM)IV型膠原α3、α4或α5鏈遺傳缺陷所致，多在10歲以前起病，部分患者在青春期甚至青春期前發(fā)展為終末期腎病[2]，其典型的病理改變是GBM分層撕裂、增厚和變薄和厚薄不均[2]。血尿是AS最早期且持續(xù)的臨床表現(xiàn)，隨著疾病進展蛋白尿逐漸出現(xiàn)[2]。持續(xù)蛋白尿預示著腎小球功能將進行性惡化[3]，但其發(fā)生機制尚未清楚。腎小球濾過屏障由足細胞足突和裂孔膜、GBM和帶窗孔的內(nèi)皮細胞組成[4]。裂孔膜是血漿蛋白濾過的主要屏障，蛋白尿的出現(xiàn)提示足突和裂孔膜損傷[5]。本研究通過觀察AS腎小球足突融合程度與GBM損傷(變薄、增厚和致密層撕裂分層)范圍以及蛋白尿的關(guān)系，以進一步理解和探討AS蛋白尿發(fā)生的可能機制。

材 料 和 方 法

1對象

對我院2008年1月～2012年4月確診的AS臨床、電鏡資料進行回顧性分析。AS診斷參照Flinter指定的標準，符合以下標準之一[1]：(1)腎小球基底膜或皮膚基底膜IV型膠原α鏈染色異常；(2)電鏡下有典型的超微結(jié)構(gòu)改變；(3)COLA3～5突變。

AS共35例，男24例，女11例，均行腎活檢病理檢查，包括光鏡、免疫熒光及電鏡檢查。腎活檢的年齡為1.17～24歲(中位年齡6歲)。根據(jù)腎活檢前的尿常規(guī)蛋白定性結(jié)果將患者分為2組：尿蛋白定性(-)、波動于(-) ～ (±)或偶因感染、劇烈運動后為+～++但感染控制或休息后尿蛋白消失者為無/間歇性蛋白尿組(13例)，尿蛋白持續(xù)+或以上者為持續(xù)性蛋白尿組(22例)。

2方法

GBM的測量：每例患者選取6～10個較完整的毛細血管袢。應用Image Pro-Plus軟件測量毛細血管袢的GBM總長度及厚度，測量時避開系膜區(qū)不規(guī)則、扭曲的GBM。GBM寬度定義為內(nèi)皮細胞膜至足細胞膜之間的距離[6]。不同年齡段GBM厚度參考范圍參照文獻[7]，分別測量變薄、增厚和撕裂分層的長度，計算出上述3個指標各占總長度的百分比。

足突寬度(foot process width，F(xiàn)PW)測量[1]：計數(shù)上述所選取的每個管袢的足突個數(shù)，根據(jù)公式計算平均FPW= π/4×(∑GBM長度/∑足突個數(shù))；FPW定義為位于任何2個相鄰濾過裂孔之間的上皮細胞片段。取6～10個毛血管袢FPW的平均值作為每例的平均FPW。

3統(tǒng)計學處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行分析。資料的統(tǒng)計描述采用中位數(shù)(最小值,最大值)[median(minimum,maximum)]，兩組比較采用Mann-Whitney非參數(shù)檢驗，兩變量之間相關(guān)性分析采用Spearman檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學差異。

結(jié) 果

12組AS患者GBM變薄、增厚和撕裂分層比較

持續(xù)性蛋白尿組GBM變薄、增厚和撕裂分層比例分別為0%(0%～37.9%)、52.6%(7.6%，100%)和24.9%(0%，100%)，無/間歇蛋白尿組GBM變薄、增厚和撕裂分層比例分別為0%(0%～19.4%)、31.8%(4.9%，64.2%)和0%(0%，80.9%)，其中前者GBM增厚和撕裂分層比例均較后者高(分別為P<0.05，P<0.01)，2組GBM變薄比例差異無顯著。不同性別患者之間GBM變薄、增厚及撕裂分層比例差異無顯著，見表1。

表12組AS患者GBM增厚、分層撕裂程度、足突寬度及腎活檢年齡比較分析

Table 1. The median percentage of GBM attenuation, thickening, splitting and layering, and renal biopsy age in the two groups[median(minimum,maximum)]

GroupAttenuationThickeningSplittingandlayeringFootprocesswidth(nm)Age(year)Non-/intervalproteinuria0%(0%,19.4%)31.8%(4.9%,64.2%)0%(0%,80.9%)771(465,1412)5.92(1.17,10.00)Persistentproteinu-ria0%(0%,37.9%)52.6%*(7.6%,100%)24.9%**(0%,100%)1400**(787,4202)9.63**(2.08,24.00)

*P<0.05,**P<0.05vsnon-/interval proteinuria.

22組AS患者FPW比較

無/間歇蛋白尿組平均FPW為771 nm(465 nm，1 412 nm)，持續(xù)性蛋白尿組平均FPW為1 400 nm(787 nm，4 202 nm)。持續(xù)性蛋白尿組患者平均FPW較無/間歇蛋白尿組足突寬度大(P<0.01)。不同性別患者之間平均FPW無統(tǒng)計學意義，見表1。

3平均FPW與GBM變薄、增厚和撕裂分層比例的相關(guān)性分析

35例AS基底膜變薄比例0%～37.9%，增厚比例4.9%～100%，致密層撕裂分層比例0%～100%，足突寬度為465～4 202 nm。平均FPW與GBM增厚和撕裂分層比例均呈正相關(guān)(分別為r=0.556和r=0.715,均P<0.01)，而GBM變薄比例與FPW無明顯相關(guān)(r=0.155,P>0.05)。

42組AS年齡分布比較

持續(xù)性蛋白尿組腎活檢年齡較無/間歇蛋白尿組大(P<0.01)，見表1。

討 論

AS是GBM的IV型膠原遺傳缺陷所致[1]，GBM形態(tài)在疾病早期并無明顯的改變，隨著疾病進展可出現(xiàn)特征性增厚、變薄、厚薄不均、致密層撕裂分層[8]。AS早期可只表現(xiàn)為血尿，蛋白尿是AS疾病進展的重要危險因素[3]，但其發(fā)生機制目前尚未十分清楚。正常情況下血漿蛋白可以通過腎小球內(nèi)皮細胞窗孔和GBM，但在足突裂孔膜處受到阻滯，提示裂孔膜是血漿蛋白濾過的主要屏障[5]。對IV型膠原COLA3敲除的AS小鼠研究發(fā)現(xiàn)，4周齡前，腎小球足突裂孔膜形態(tài)和結(jié)構(gòu)無異常改變，小鼠無明顯蛋白尿；第5周出現(xiàn)蛋白尿，足突融合，裂孔膜消失及裂孔膜蛋白表達改變，提示AS小鼠尿蛋白的發(fā)生主要與足突融合和裂孔膜損傷有關(guān)[9]。本研究結(jié)果顯示AS足突損傷程度(足突寬度)與尿蛋白量呈正相關(guān)[1]。提示AS蛋白尿的發(fā)生與足突損傷有關(guān)，但AS患者GBM成分異常是如何導致足突損傷的，目前仍不清楚。

有研究發(fā)現(xiàn)，在AS小鼠模型，AS基底膜早期改變是異常層黏連蛋白積聚，導致GBM局部增厚，足突消失下方及增厚的GBM區(qū)域?qū)D(zhuǎn)鐵蛋白的通透性最高[3]。White等[6]研究發(fā)現(xiàn)，蛋白尿嚴重的AS患者GBM增厚的范圍大，提示蛋白尿的濾出主要在GBM增厚部分。本研究結(jié)果顯示持續(xù)性蛋白尿組GBM損傷范圍及足突融合程度較無/間歇性蛋白尿組大，且足突融合程度與GBM損傷范圍呈正相關(guān)。提示AS足突損傷與GBM改變有關(guān)，且有可能是繼發(fā)于后者的改變。因此，推測AS基底膜異常有可能是通過引起足突損傷導致蛋白尿發(fā)生的。但有關(guān)GBM異常與足細胞之間的相互作用機制有待于分子水平更為深入的研究。

此外，本研究發(fā)現(xiàn)AS的GBM變薄范圍與足突融合程度及蛋白尿無明顯相關(guān)，提示變薄可能不是反映GBM損傷程度的敏感指標。本研究結(jié)果還顯示持續(xù)性蛋白尿組腎活檢年齡較另一組大，提示持續(xù)蛋白尿與患者年齡增長及疾病進展有關(guān)，能在一定程度上反映疾病嚴重程度和預示疾病的進展。

綜上所述，AS足突損傷與GBM損傷程度以及蛋白尿水平相關(guān)，GBM異常有可能是通過影響足突的結(jié)構(gòu)和功能導致蛋白尿發(fā)生的，但其機制仍需進一步研究。闡明AS蛋白尿的發(fā)生機理，將有助于揭示其腎小球損害進展的機制，為AS治療提供新思路和理論依據(jù)。

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RelationshipbetweenultrastructurallesionsofglomerularfiltrationbarrierandproteinuriainAlportsyndrome

WANG Hai-yan1, SUN Liang-zhong1, WU Jin-lang2, JIANG Xiao-yun1, MO Ying1,TONG Hua-juan1

(1DepartmentofPediatrics,theFirstAffiliatedHospital,2DepartmentofElectronMicroscope,ZhongshanSchoolofMedicine,SunYat-senUniversity,Guangzhou510080,China.E-mail:sunlzh@mail.sysu.edu.cn)

AIM: To explore the relationship between the ultrastructural lesions of glomerular filtration barrier (GFB) and proteinuria in Alport syndrome (AS).METHODSThirty-five AS patients (24 males and 11 females), who were admitted to our hospital from 2008 to 2012, were enrolled in this study. The median age was 6 years (1.17 ～ 24 years) according to the time of renal biopsy. The data of clinical and electron microscopic examination were collected for retrospective analysis. The patients were divided into 2 groups according to the degree of urinary protein: non-/interval proteinuria group (13 cases) and persistent proteinuria group (22 cases). The length of glomerular basement membrane(GBM) attenuation, thickening, and dense layer splitting and layering was measured, and the percentages of these lesions were calculated. The foot process width (FPW) was measured according to the formula average FPW=π/4× (∑ GBM length/∑ foot process number). The differences of the ultrastructural lesions in GFB between the 2 groups were compared, and the association between GFB ultrastructural lesions and proteinuria were analyzed.RESULTSThe percentages of GBM thickening, splitting and layering were higher, and the foot processes were wider in persistent proteinuria group than those in non-/interval proteinuria group. The median age at renal biopsy in persistent proteinuria group was older than that in non-/interval proteinuria group. The average FPW of the 35 patients was positively correlated with the percentage of GBM thickening, splitting and layering, and the age at biopsy, respectively.CONCLUSIONThe severity of GBM lesions is associated with the severity of foot process damage and the severity of proteinuria, suggesting that foot process damage associated with proteinuria in AS may be secondary to GBM lesions.

Alport syndrome; Glomerular basement membrane; Podocytes; Proteinuria

R322.6+1

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.02.031

1000- 4718(2013)02- 0361- 03

2012-08-31

2012-11-01

廣東省自然科學基金資助項目(No.S2012010009405)；廣東省科技計劃(No.2011B031800126);高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費中山大學青年教師培育項目(No.09ykpy40)

△通訊作者 Tel:020-87755766-8310;E-mail:sunlzh@mail.sysu.edu.cn