胡道川， 姬文婕， 陳雪芬， 馬永強， 周 欣， 魏路清△

(武裝警察部隊后勤學院附屬醫(yī)院 1呼吸與重癥醫(yī)學科， 2心臟中心，武警部隊心血管病研究所， 天津 300162)

▲并列第1作者

鹽皮質(zhì)激素受體在博來霉素誘導的實驗性肺纖維化中的作用*

胡道川1▲， 姬文婕1▲， 陳雪芬1， 馬永強1， 周 欣2， 魏路清1△

(武裝警察部隊后勤學院附屬醫(yī)院1呼吸與重癥醫(yī)學科，2心臟中心，武警部隊心血管病研究所， 天津 300162)

目的研究鹽皮質(zhì)激素受體(MR)在博來霉素誘導的實驗性肺纖維化進展過程中的作用及機制。方法將126只6～8周齡雄性C57BL/6小鼠隨機分為對照組、博來霉素組和MR阻斷劑螺內(nèi)酯干預組，氣管內(nèi)一次性滴注博來霉素(2.5 mg/kg)溶液建立實驗性小鼠肺纖維化模型，螺內(nèi)酯干預組每天按螺內(nèi)酯20 mg/kg經(jīng)灌胃給藥。于術(shù)后12 h、1 d、2 d、3 d、7 d、14 d和28 d處死小鼠，采用HE染色和Masson染色觀察肺組織病理學變化及纖維化程度，采用real-time PCR檢測各組肺組織中膠原1(Col1)、Col3、轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)、單核細胞趨化蛋白1(MCP-1)及MR mRNA的表達水平。結(jié)果(1)與對照組小鼠相比，博來霉素組及螺內(nèi)酯干預組小鼠在滴注博來霉素后經(jīng)歷了典型的急性炎癥期(12 h～3 d)、纖維化進展期(14 d)和纖維化晚期(28 d)。阻斷MR下調(diào)早期炎癥反應并減輕了纖維化程度。(2)螺內(nèi)酯干預可以有效降低MR mRNA表達水平；阻斷MR在急性炎癥期顯著下調(diào)MCP-1 mRNA的表達，在14 d顯著下調(diào)TGF-β、Col1和Col3 mRNA表達水平。結(jié)論(1)阻斷MR可以明顯減輕博來霉素誘導的肺纖維化程度；(2)阻斷MR可能通過在急性炎癥期調(diào)節(jié)MCP-1和TGF-β的表達，減輕炎癥反應，并在纖維化進展期，下調(diào)TGF-β的表達，從而抑制肺纖維化的進展。

肺纖維化； 受體，鹽皮質(zhì)激素； 博來霉素； 螺內(nèi)酯

特發(fā)性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis, IPF)是一種原因不明的進展性、致死性的纖維化性間質(zhì)性肺炎。目前，IPF的發(fā)病機制尚不明確，尚無有效治療手段。IPF患者診斷后的平均存活時間僅為2～5年[1]。鹽皮質(zhì)激素受體(mineralocorticoid receptor, MR)是一種典型的胞核甾體類激素受體，它的經(jīng)典配體為醛固酮。MR在機體內(nèi)表達廣泛。在腎臟、肺臟、免疫系統(tǒng)、神經(jīng)組織以及心臟等部位均有表達[2]。MR活化除了調(diào)節(jié)水鹽平衡以外，還參與誘導炎性反應、膠原形成、纖維化、細胞壞死、代謝綜合征等病理生理過程[3]。目前，鮮有關(guān)于MR與肺纖維化關(guān)系的研究。本研究使用博來霉素誘導的小鼠肺纖維化模型，采用MR阻斷劑(螺內(nèi)酯)阻斷MR，檢測MR、單核細胞趨化蛋白1(monocyte chemoattractant protein 1, MCP-1)、轉(zhuǎn)化生長因子 β(transforming growth factor β, TGF-β)mRNA在纖維化過程中的表達情況，探討MR在博來霉素誘導的實驗性肺纖維化進展過程中的作用及分子機制。

材 料 和 方 法

1動物

健康雄性C57BL/6小鼠，6～8周齡，體重16～20 g，由中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心提供，許可證號為SCXK-(軍)2007-004。

2主要試劑

注射用鹽酸平陽霉素(博來霉素A5，天津太河制藥有限公司)，螺內(nèi)酯(Sigma)，TRIzol Reagent(Invitrogen)，MMLV反轉(zhuǎn)錄酶、dNTPs(Promega)，SYBR Green實時定量PCR試劑盒(Roche)，戊巴比妥鈉(Sigma)，其余國產(chǎn)試劑均為分析純。

3主要方法

3.1動物模型的制備、標本的采集與處理 隨機將126只C57BL/6小鼠分為對照組(control)、博來霉素組(bleomycin, Bleo)和螺內(nèi)酯(spironolactone, Spiro)干預組(Bleo+Spiro)，每組42只。腹腔內(nèi)注射戊巴比妥鈉(40 mg/kg)對小鼠進行麻醉后，在無菌條件下，于頸部正中縱向剪開皮膚，逐層分離肌肉，暴露氣管。博來霉素組按劑量2.5 mg/kg體重，經(jīng)氣管內(nèi)一次性注入博來霉素生理鹽水溶液0.05 mL，按摩胸腔，使藥物分布均勻。最后縫合皮膚，常規(guī)喂養(yǎng)。對照組氣管內(nèi)注入等體積生理鹽水。螺內(nèi)酯干預組螺內(nèi)酯按20 mg/kg，每天1次，經(jīng)灌胃給藥。各組小鼠分別于模型制備完畢后第12 h、1 d、2 d、3 d、7 d、14 d和28 d，麻醉后摘眼球放血致死，每組各取6只，開胸將肺臟連同氣管取出，分離左肺，4%多聚甲醛溶液固定，經(jīng)石蠟包埋切片，行HE染色和Masson染色；右肺凍存于液氮中，用于肺組織RNA的提取與分析。

3.2病理學分析 肺組織經(jīng)4%多聚甲醛固定后常規(guī)石蠟包埋，切片(5 μm)，按常規(guī)方法進行HE染色和Masson染色，在光學顯微鏡下觀察肺組織的炎癥反應和纖維化程度。

3.3實時定量PCR檢測肺組織中目的基因的表達 按照試劑說明書標準操作步驟，采用TRIzol Reagent提取各組組織的總RNA，Nanodrop 2000c紫外/可見分光光度儀對其定量。RNA甲醛變性電泳法驗證其完整性后將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后以SYBR Green法進行PCR擴增，每個樣本設置2個復孔，實驗結(jié)果重復3次。根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中目的基因cDNA序列，使用Primer Premier 6.0軟件設計特異性引物，由北京三博遠志生物技術(shù)有限公司合成，序列見表1。

表1 目的基因引物序列

F: forward primer; R: reverse primer.

4統(tǒng)計學處理

采用SPSS 19.0軟件分析，計量資料以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示。組間比較采用t檢驗和方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1各組小鼠肺組織的病理學變化

光鏡下可見，對照組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)基本正常，未見明顯炎癥細胞浸潤，肺間質(zhì)未見膠原沉積。博來霉素組小鼠在滴注博來霉素后第3天表現(xiàn)為明顯的急性炎癥反應，肺泡壁水腫，肺間質(zhì)內(nèi)可見炎癥細胞浸潤；第7天肺泡間隔增厚，可見大量炎癥細胞浸潤，Masson染色示肺間質(zhì)少量膠原沉積；第14天炎癥細胞浸潤明顯減少，肺泡間隔明顯增厚，膠原沉積明顯增多，肺泡結(jié)構(gòu)破壞、塌陷；第28天肺泡結(jié)構(gòu)明顯破壞，肺泡腔融合，肺間質(zhì)膠原沉積較第14天有所減少。與對照組小鼠相比，博來霉素組小鼠在滴注博來霉素后經(jīng)歷了典型的急性炎癥期(12 h～3 d)、纖維化進展期(14 d)和纖維化晚期(28 d)，見圖1。

Figure 1. Histologic evaluation of control and bleomycin-treated (3, 7, 14 and 28 d) mouse lung tissues (×200).

圖1對照組和實驗組小鼠在滴注博來霉素后第3天、7天、14天和28天肺組織HE染色和Masson染色

與博來霉素組相比，螺內(nèi)酯干預后的小鼠肺臟炎癥反應明顯減輕，炎癥細胞浸潤減少，見圖2；在纖維化進展期(14 d)，螺內(nèi)酯干預組纖維化程度顯著減輕，膠原沉積面積統(tǒng)計存在顯著差異，見圖3。

2肺組織中膠原1(collagen1，Col1)和Col3mRNA的表達

與博來霉素組相比，螺內(nèi)酯干預組在第14天Col1 mRNA表達水平顯著降低(P<0.05)，見圖4A；Col3 mRNA表達量在第7天和第14天均顯著下降(P<0.05和P<0.01)，見圖4B。

3肺組織中MR、MCP-1和TGF-βmRNA的表達

在急性炎癥期和纖維化進展期，螺內(nèi)酯干預組肺組織中MR mRNA表達水平較博來霉素組顯著降低，見圖5A。

博來霉素組小鼠肺組織中MCP-1 mRNA表達水平在急性炎癥期明顯高于對照組及螺內(nèi)酯干預組，此外還顯著高于其第7天和第14天的表達水平(P<0.05)；螺內(nèi)酯干預組MCP-1 mRNA的表達水平顯著下調(diào)，見圖5B。

在第3天，與博來霉素組相比，螺內(nèi)酯干預組小鼠肺組織中TGF-β mRNA的表達顯著增高(P<0.05)，第14天，螺內(nèi)酯干預組TGF-β mRNA的表達水平明顯下降(P<0.01)，見圖5C。

討 論

博來霉素誘導的小鼠肺纖維化模型是目前應用最廣泛的IPF模型[4]。給予博來霉素后首先引起小鼠肺上皮細胞損傷，繼而導致以中性粒細胞和淋巴細胞為主的炎癥反應，最終導致肺纖維化。在炎癥反應期，多種炎癥趨化因子、細胞因子和生長因子的表達升高[5]。這些介質(zhì)通過募集、活化和促進成纖維細胞、巨噬細胞、中性粒細胞和肌成纖維細胞增殖來發(fā)揮其促纖維化作用。炎癥反應對于肺纖維化的發(fā)生、發(fā)展起到至關(guān)重要的作用。

Figure 2. Histologic changes of lung tissues from each group 12 h, 24 h, 48 h, 3 d and 7 d after intratracheal instillation of bleomycin(HE staining,×200).

圖2各組小鼠在第12h、24h、48h、3d和7d肺組織HE染色

Figure 3. Masson trichrome staining (×200) revealed that pulmonary fibrosis was attenuated in Bleo+Spiro-treated mice on the 14th day after intratracheal instillation of Bleo.Mean±SD.n=6.**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsBleo.

圖3各組小鼠在第14天肺組織Masson染色

Figure 4. Expression of collagen 1 (Col1) mRNA (A) and Col3 mRNA (B) in Bleo and Bleo+Spiro groups.Mean±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01vsBleo.

圖4螺內(nèi)酯干預后小鼠肺臟中Col1和Col3mRNA表達水平顯著下降

Figure 5. Expression of MR (A), MCP-1 (B) and TGF-β (C) mRNA in Bleo and Bleo+Spiro groups.*P<0.05,**P<0.01vsBleo+Spiro;#P<0.05vsBleo at 7 d.

圖5螺內(nèi)酯干預后小鼠肺臟中MR、MCP-1和TGF-βmRNA表達水平

MR是一種典型的胞核甾體類激素受體，它的經(jīng)典配體為醛固酮。MR在機體內(nèi)分布廣泛，并發(fā)揮著多種生物學功能。MR參與調(diào)節(jié)水鹽平衡、誘導炎性反應、纖維化、細胞凋亡、代謝綜合征等病理生理過程，MR的活化可以增強NAPDH氧化酶的活性，產(chǎn)生大量氧自由基[6]。Habibi等[7]闡明氧化應激水平的上調(diào)是MR介導纖維化的關(guān)鍵機制之一。MR在免疫細胞如單核細胞、B淋巴細胞和T淋巴細胞均有表達。MR的活化狀態(tài)與免疫狀態(tài)密切相關(guān)。MR活化可以誘導免疫細胞從血管滲出，增加促炎因子的產(chǎn)生與釋放，促進炎癥狀態(tài)[2]。Bergmann等[8]發(fā)現(xiàn)激活的MR可以通過激活NF-κB，誘導炎癥細胞分泌MCP-1、IL-1、TNF-α等大量的促炎因子，從而誘導免疫系統(tǒng)處于激發(fā)狀態(tài)。這些炎癥因子在纖維化的起始環(huán)節(jié)發(fā)揮了非常重要的作用[9]。MR的激活可以上調(diào)如TGF-β的合成與分泌[10]。轉(zhuǎn)化生長因子是肺纖維化發(fā)病過程中最重要的細胞活性物質(zhì)。轉(zhuǎn)化生長因子可以促進EMT，激活成纖維細胞轉(zhuǎn)變成肌成纖維細胞，并直接刺激成纖維細胞合成、分泌大量細胞外基質(zhì)，促進肺纖維化的發(fā)展[11]。Rickard等[12]研究發(fā)現(xiàn)通過基因敲除巨噬細胞的MR可以抑制去氧皮質(zhì)酮/鹽誘導的心肌纖維化，許明等[13]也發(fā)現(xiàn)使用安體舒通抑制MR可以改善自發(fā)性高血壓大鼠的心肌纖維化。

目前，鮮有關(guān)于MR與肺纖維化關(guān)系的研究。本研究發(fā)現(xiàn)，MCP-1 mRNA表達趨勢與MR相一致。在急性炎癥期博來霉素組小鼠MCP-1 mRNA表達量明顯高于對照組。阻斷MR可能通過調(diào)控MCP-1的表達，進而減輕炎癥反應。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，在給予博來霉素后第3天，阻斷MR還可能通過上調(diào)TGF-β的表達，發(fā)揮抗炎作用；而在第14天，博來霉素組小鼠肺臟中TGF-β的合成與分泌顯著升高，促進肺纖維化。

綜上所述，MR參與了肺纖維化的發(fā)生與進展過程，阻斷MR可能主要通過影響MCP-1和TGF-β的表達，減輕早期炎癥反應，并在纖維化進展期抑制TGF-β的合成，從而發(fā)揮抑制肺纖維化的作用。下一步研究擬通過阻斷或者激活MR的體內(nèi)外實驗，探討MR在肺纖維化中發(fā)揮促纖維化作用的具體分子機制及其作為肺纖維化預防和治療靶點的可能性。

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Roleofmineralocorticoidreceptorinbleomycin-inducedpulmonaryfibrosis

HU Dao-chuan1, JI Wen-jie1, CHEN Xue-fen1, MA Yong-qiang1, ZHOU Xin2, WEI Lu-qing1

(1DepartmentofRespiratoryMedicineandIntensiveCareUnit,2CardiacCenter,InstituteofCardiovascularDiseases,HospitalAlliliatedtoLogisticsUniversityofChinesePeople’sArmedPoliceForces,Tianjin300162,China.E-mail:luqing-wei@163.com)

AIM: To investigate the role of mineralocorticoid receptor (MR) in the lungs of experimental fibrotic mice.METHODSC57BL/6 male mice (6～8 weeks old) were randomly divided into control group, bleomycin treatment group (Bleo) and bleomycin+spironolactone treatment group (Bleo+Spiro). For induction of pulmonary fibrosis, the mice were administered bleomycin at dose of 2.5 mg/kg dissolved in 50 μL saline by the intratracheal route or given 50 μL sterile saline as control. The mice in Bleo+Spiro group were treated with spironolactone (20 mg/kg) daily by oral gavage throughout the experiment. The mice were sacrificed at 12 h, 1 d, 2 d, 3 d, 7 d, 14 d and 28 d after administration of bleomycin. HE staining and Masson’s trichrome staining were used to conduct histopathologic examination. The mRNA expression levels of collagen 1 (Col1), collagen 3 (Col3), transforming growth factor beta (TGF-β), monocyte chemoattractant protein 1 (MCP-1), and MR were examined by real-time PCR.RESULTSThe results of histological analysis revealed the classical pathological stages of bleomycin-induced lung fibrosis, including acute inflammation phase (from 12 h to 3 d), progressive fibrosis phase (14 d) and late fibrosis phase (28 d). Compared with Bleo group, the inflammatory responses of the lungs in Bleo+Spiro group were attenuated in the acute inflammation phase and the degree of fibrosis was significantly reduced at 14 d after administration of bleomycin. Treatment with spironolactone effectively down-regulated the mRNA expression of MR. The levels of MCP-1 (in the acute inflammation phase), TGF-β (at 14 d), Col1 and Col3 (at 14 d) were also significantly reduced.CONCLUSIONBlockage of MR significantly attenuates the degree of bleomycin-induced pulmonary fibrosis by regulating the production and secretion of MCP-1 and TGF-β, thus reducing the degree of inflammation and inhibiting the expression of TGF-β in the progressive fibrotic phase.

Pulmonary fibrosis; Receptors, mineralocorticoid; Bleomycin; Spironolactone

R329.21

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.11.022

1000- 4718(2013)11- 2039- 05

2013- 06- 19

2013- 09- 27

國家自然科學基金資助項目(No.81102088)；天津市應用基礎研究面上項目(No.11JCYBJC11800;No.12JCYBJC16600)；武警醫(yī)學院博士啟動基金資助項目(No.WYB201108)

△通訊作者 Tel: 022-60577559; E-mail: luqing-wei@163.com