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        磷酸化MEK2(Thr394)在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及其臨床意義*

        2013-12-01 02:29:10王道海黃美近劉煥亮汪建平
        中國病理生理雜志 2013年11期
        關(guān)鍵詞:胞核胞漿陽性細(xì)胞

        彭 慧, 王道海, 胡 英, 王 磊, 黃美近, 劉煥亮, 汪建平△

        (1中山大學(xué)附屬第六醫(yī)院結(jié)直腸外科,2中山大學(xué)胃腸病研究所,廣東廣州510655;

        3河南省腫瘤醫(yī)院普外科,河南鄭州450008;4中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院特診中心,廣東廣州510080)

        結(jié)直腸癌(colorectal cancer,CRC)的形成和發(fā)展是一個多因素多階段的復(fù)雜病理過程,其涉及到腸上皮細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、逃避反應(yīng)機(jī)制,而這些機(jī)制均由細(xì)胞內(nèi)外的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑所調(diào)控。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的異常往往導(dǎo)致細(xì)胞增殖和凋亡失控,與結(jié)直腸癌的發(fā)生密切相關(guān)[1-2]。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activaited protein kinase,MAPK)通路是細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要途徑,可以將多種細(xì)胞外信號通過磷酸化活化逐級傳遞至細(xì)胞內(nèi),參與細(xì)胞生長、分裂、分化及凋亡等多種生理過程,并在細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化中起重要作用[3-6]。MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子——絲裂原細(xì)胞外激酶1/2(mitogen extracellular kinase 1/2,MEK1/2)可被多種炎癥因子、生長因子和環(huán)境應(yīng)激反應(yīng)等通過磷酸化而激活,從而產(chǎn)生不同的生物學(xué)效應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)MEK1/2的多個磷酸化位點(diǎn)的生物學(xué)效應(yīng)與結(jié)直腸癌的發(fā)生相關(guān)[5-6],但MEK2蛋白第394位點(diǎn)蘇氨酸(Thr394)的磷酸化及其在人結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中的影響卻鮮有報道。

        本研究旨在通過組織芯片-免疫組織化學(xué)的方法檢測Thr394磷酸化的MEK2[p-MEK2(Thr394)]蛋白在結(jié)直腸癌、結(jié)直腸腺瘤和結(jié)直腸旁正常上皮組織中的表達(dá)情況,并進(jìn)一步分析其與結(jié)直腸腺癌臨床病理參數(shù)及預(yù)后的關(guān)系,初步探討 p-MEK2(Thr394)在結(jié)直腸腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用及臨床意義。

        材料和方法

        1 材料

        本研究共收集2組樣本。第1組:隨機(jī)收集2007年5月~2010年12月間中山大學(xué)附屬第六醫(yī)院結(jié)直腸癌病例組織石蠟包埋標(biāo)本144例,其中結(jié)直腸腺癌組織96例,結(jié)直腸腺瘤組織24例,癌旁正常組織(距離腫瘤邊緣5 cm以上)24例,所有病例切片均獲病理診斷確認(rèn)。第2組:隨機(jī)收集2000年1月~2005年12月間中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院收治的結(jié)直腸癌病例417例,均具備完整臨床病理參數(shù)和預(yù)后資料。成功取樣并有染色結(jié)果的病例為337例,均經(jīng)病理組織學(xué)證實(shí)?;颊哳A(yù)后隨訪方式:查閱病歷資料;定期電話詢問或通信;家庭訪視。隨訪日期為自首次手術(shù)日期開始起,每3個月隨訪1次。生存時間自首次手術(shù)之日起計(jì)算,隨訪終點(diǎn)為患者死亡日期或末次隨訪日期,隨訪截止時間為2010年8月31日,生存期以月為單位計(jì)算。剔除失訪患者后剩余341例納入生存分析。本研究獲中山大學(xué)倫理委員會同意,所有參加人員均知情同意。兔抗人p-MEK2(Thr394)單克隆抗體購自Santa Cruz,抗體編號bs5427R。

        2 方法

        2.1 組織芯片制備 使用切片石蠟制備27 mm×22 mm×10 mm的受體蠟塊,并于蠟塊構(gòu)建12×8共96點(diǎn)組織陣列,2個相鄰樣本間距為1 mm。由資深病理科醫(yī)生在40倍顯微鏡像下確認(rèn)并定位標(biāo)記供體組織蠟塊,用組織芯片制作儀(Alphelys)穿取直徑1.0 mm供體組織放入受體蠟塊中,每一標(biāo)本選取2個位點(diǎn)。用石蠟切片機(jī)對組織芯片蠟塊進(jìn)行連續(xù)切片,厚度為4μm。

        2.2 免疫組織化學(xué)法檢測 采用EnVision染色法檢測p-MEK2(Thr394)在各組織中的表達(dá)部位及強(qiáng)度。主要步驟如下:常規(guī)脫蠟入水,玻片置3%H2O2中10 min,磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution,PBS)沖洗3次,置檸檬酸鈉抗原修復(fù)液(pH=6.0)高溫20 min,PBS沖洗3次,加I抗并4℃恒溫過夜;PBS沖洗4次,加II抗HRP液37℃避光孵育1 h,PBS沖洗4次,DAB顯色,蘇木素復(fù)染,二甲苯透明,中性樹膠封片,鏡檢。PBS代替I抗作為陰性對照,結(jié)直腸癌組織陽性切片作為陽性對照。

        2.3 結(jié)果判讀及評分標(biāo)準(zhǔn) p-MEK2(Thr394)陽性表達(dá)信號為細(xì)胞漿或細(xì)胞核中出現(xiàn)黃色物且其染色強(qiáng)度高于背景非特異染色者,或棕黃色顆粒沉淀。采用雙盲法閱片,根據(jù)陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)和著色強(qiáng)度綜合記分。陽性細(xì)胞著色強(qiáng)度評分:0分為陰性(不顯色),1分為弱(淺灰黃色),2分為中(淡黃色),3分為稍強(qiáng)(黃色),4分為強(qiáng)(棕黃色)。陽性細(xì)胞百分率:0分為無陽性細(xì)胞,1分為陽性細(xì)胞 1% ~25%,2分為陽性細(xì)胞26% ~50%,3分為陽性細(xì)胞51% ~75%,4分為陽性細(xì)胞76% ~100%。結(jié)果判讀采用半定量積分分級:積分=染色強(qiáng)度×染色細(xì)胞比例。當(dāng)同一標(biāo)本的2個組織芯片評分結(jié)果不一致時,取兩者的平均值。

        3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

        采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件處理。應(yīng)用χ2檢驗(yàn)分析p-MEK2(Thr394)在不同組織中的陽性表達(dá)差異及其與各項(xiàng)臨床參數(shù)的相關(guān)性。采用Kaplan-Meier方法分析p-MEK2(Thr394)表達(dá)與結(jié)直腸癌患者生存的相關(guān)性。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        結(jié) 果

        1 p-MEK2(Thr394)蛋白的表達(dá)情況

        p-MEK2(Thr394)蛋白在癌旁正常黏膜和腺瘤組織中表達(dá)均位于胞漿,未見明顯胞核染色。在腺癌組織中有4例表達(dá)位于胞核和胞漿,剩余陽性表達(dá)者均位于胞核,見圖1。根據(jù)評分標(biāo)準(zhǔn),在本組144例標(biāo)本中,p-MEK2表達(dá)的平均值為7.36,以≥7分定義為高表達(dá)、<7分為低表達(dá)分為2組。24例癌旁正常黏膜標(biāo)本均為高表達(dá)(100%),未見低表達(dá)(0%),平均值 15.41;24例腺瘤標(biāo)本中,平均值7.66,16 例高表達(dá)(66.7%),8 例低表達(dá)(33.3%)。96例腺癌標(biāo)本中,表達(dá)平均值3.83,19例高表達(dá)(19.8%),77例低表達(dá)(80.2%)。經(jīng)過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:三者總體比較有顯著差異(χ2=58.93,P <0.01)。p-MEK2在癌旁正常組織中的表達(dá)明顯高于結(jié)直腸腺瘤組織(χ2=9.60,P <0.05),也明顯高于結(jié)直腸癌組織(χ2=53.72,P <0.01),在結(jié)直腸腺瘤組織中表達(dá)明顯高于癌組織(χ2=20.42,P <0.01),見表1。96例CRC中的p-MEK2(Thr394)的異常表達(dá)與各臨床病例參數(shù)之間均無相關(guān)性,見表2。

        Figure 1.Immunohistochemical staining of colorsctal cancer tissues for p-MEK2(×400).A:negative(0 score);B:positive(1score,yellowish gray);C:positive(2 score,pale yellow);D:positive(3 score,yellow);E:positive(4 score,brown).圖1 p-MEK2在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)

        表1 p-MEK2(Thr394)在結(jié)直腸正常黏膜、腺瘤和腺癌中的表達(dá)Table 1.p-MEK2(Thr394)expression in normal mucosa,adenoma,adenocarcinoma of colorectum

        2 第2組樣本中p-MEK2(Thr394)蛋白的表達(dá)情況

        第2組結(jié)直腸癌標(biāo)本組中,成功取樣并且有染色結(jié)果的共337例,表達(dá)的平均值為4.36。以>4分定義為高表達(dá),≤4分為低表達(dá),共分為2組,其中203 例低表達(dá)(60.2%),134 例高表達(dá)(39.8%)。p-MEK2與性別、年齡、大體分型、組織分型、分化程度、TNM分期等參數(shù)均無明顯相關(guān)性(P>0.05),見表3。

        表2 第1組病例中p-MEK2(Thr394)表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系Table 2.The relationships between the expression of p-MEK2(Thr394)and the clinicopathological characteristics in the first group

        3 p-MEK2的表達(dá)同結(jié)直腸癌預(yù)后的相關(guān)性

        Kaplan-Meier分析表明,p-MEK2的表達(dá)同結(jié)直腸癌患者5年生存率無明顯相關(guān)性,log-rank檢驗(yàn)P >0.05,見圖2。

        4 p-MEK2在胞漿及胞核中的表達(dá)

        在第2組結(jié)直腸癌標(biāo)本中,p-MEK2也存在胞漿及胞核中同時表達(dá)的現(xiàn)象。合并2組結(jié)直腸癌標(biāo)本數(shù)據(jù),共有24例(5.6%)標(biāo)本存在漿核陽性。比較胞漿表達(dá)與胞漿胞核同時表達(dá),2組的臨床病理參數(shù)及預(yù)后均無顯著差異(P>0.05),見表4。

        討 論

        作為MAPK信號通路的最下游,ERK1/2蛋白的活性范圍及持續(xù)時間,是細(xì)胞對外來刺激反應(yīng)的重要決定因素。在細(xì)胞內(nèi)存在著多種關(guān)鍵調(diào)節(jié)機(jī)制,來維持ERK1/2蛋白的激活與失活之間的平衡。這種平衡對于維持細(xì)胞正常的增殖、分化及凋亡,起著重要的作用。ERK1/2蛋白激酶的失活主要靠去磷酸化已被磷酸化的蘇氨酸和(或)絲氨酸來完成。生物學(xué)和基因?qū)W的研究表明,有活性的ERK1/2蛋白可以在體內(nèi)被特異性的酪氨酸磷酸酶和雙特異性MAPK磷酸酶失活,從而起到負(fù)性調(diào)節(jié)ERK1/2和其它MAPK蛋白激酶的活性[7-9]。但是,關(guān)于 ERK MAPK通路本身各級激酶對ERK1/2活性影響的卻大多數(shù)集中在正性調(diào)節(jié)上。

        MEK1/2作為ERK MAPK通路的中心組成部分,同時也是目前已知僅有的2個ERK1/2蛋白激活酶,是我們目前研究腫瘤靶向治療的又一熱門潛在靶點(diǎn)。抑制MEK1/2可以通過阻斷異常的信號轉(zhuǎn)導(dǎo),抑制腫瘤細(xì)胞的分化、增殖。這種抑制同時還有不受上游異常癌基因(K-ras和BRAF突變)影響的優(yōu)點(diǎn)?,F(xiàn)在已有多種 MEK抑制劑進(jìn)入臨床試驗(yàn)[10-11]。目前關(guān)于MEK1/2蛋白與腫瘤的發(fā)病機(jī)制的研究只集中于激酶領(lǐng)域,存在于MEK2蛋白C末端第394位的蘇氨酸殘基卻從未被報道過。本實(shí)驗(yàn)通過免疫組化的實(shí)驗(yàn)方法將p-MEK2蛋白的表達(dá)狀況與結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展的不同階段聯(lián)系起來,研究Thr394位點(diǎn)磷酸化在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用。

        近年來的研究表明,MAPK信號通路在結(jié)直腸癌的形成中大都處于異常激活狀態(tài)[12]。Deng等[13]通過對123例結(jié)直腸癌的免疫組化研究發(fā)現(xiàn),激活狀態(tài)的MEK1/2在76%(93例)結(jié)直腸癌中高表達(dá),而在正常腸上皮組織中只有很弱的表達(dá),或者不表達(dá)。這恰恰與p-MEK2(Thr394)的表達(dá)呈相反趨勢。本研究檢測p-MEK2(Thr394)在結(jié)直腸正常上皮組織、腺瘤和腺癌組織中的表達(dá)情況,其表達(dá)呈明顯的遞減趨勢,高表達(dá)率分別為100%、66.7%和19.8%。統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果顯示三者總體比較具有顯著差異(P<0.01);三者的兩兩比較也具有顯著差異。二者這種截然不同的表達(dá)結(jié)果提示我們:在結(jié)直腸癌的發(fā)展過程中,MEK2第394位點(diǎn)蘇氨酸殘基的磷酸化,在某種意義上可以作為一種保護(hù)因素,抑制癌癥的發(fā)生。正是這種抑癌因素與促癌因素(MEK1/2異常激活)之間的平衡被打破,正常的腸上皮細(xì)胞開始向腫瘤轉(zhuǎn)化。

        表3 p-MEK2的表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系Table 3.The relationships between the expression of p-MEK2(Thr394)and the clinicopathological characteristic in colorectal carcinoma

        Figure 2.Kaplan-Meier analysis of association between p-MEK2 expression and survival rate of colorectal cancer patients.圖2 p-MEK2的表達(dá)水平與結(jié)直腸癌患者5年生存率的關(guān)系

        表4 p-MEK2在2組腺癌標(biāo)本胞漿、胞核中的陽性表達(dá)Table 4.The positive expression of p-MEK2(Thr394)in the cytoplasm and nucleus of adenocarcinoma samples

        本研究另外一個目的是研究p-MEK2(Thr394)蛋白表達(dá)與結(jié)直腸癌患者的各種臨床參數(shù)及預(yù)后的相關(guān)性。通過不同的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,我們發(fā)現(xiàn),p-MEK2(Thr394)蛋白的表達(dá)與結(jié)直腸癌的各種臨床參數(shù)(如年齡、性別、分化程度、分期)以及預(yù)后均無明顯相關(guān)性,這個結(jié)果提示我們,p-MEK2(Thr394)的失表達(dá)可能對腫瘤的發(fā)生階段起著重要的調(diào)控作用,但在腫瘤的進(jìn)展過程中,其下游其它因子的作用更大。

        本研究同時還發(fā)現(xiàn),在 2組的 p-MEK2(Thr394)陽性表達(dá)的結(jié)直腸癌標(biāo)本(共300例)中,44例同時存在于胞漿及胞核中。激活狀態(tài)的MEK1/2可以在胞漿及胞核中表達(dá),這種現(xiàn)象已經(jīng)在Deng等[13]的實(shí)驗(yàn)中得到證實(shí)。Georgieva 等[14]則對其機(jī)制和作用進(jìn)行了研究。他們的研究表明,激活狀態(tài)的MEK1/2可以自由地進(jìn)出于胞漿及胞核之間。MEK1/2進(jìn)入胞核主要靠被動擴(kuò)散機(jī)制,它由胞核進(jìn)入到胞漿則是靠其位于蛋白N端的一個短的富含亮氨酸的信號肽。這條肽鏈又稱核轉(zhuǎn)出信號肽(nuclear export signal,NES),它位于 MEK1/2 蛋白的第31號氨基酸殘基到第51號殘基之間。NES信號肽的存在使得MEK1/2可以以主動轉(zhuǎn)運(yùn)的形式回到胞漿,正是這種主動轉(zhuǎn)運(yùn)使得與MEK1/2結(jié)合的ERK1/2可以在胞漿重新定位,這也是目前我們已知的唯一一個轉(zhuǎn)運(yùn) ERK1/2出胞核的途徑[15]。p-MEK2(Thr394)蛋白也存在N端的NES肽段,它在細(xì)胞核中的表達(dá)提示,Thr394的磷酸化也可能存在對ERK1/2重新定位的調(diào)節(jié)。

        盡管目前我們對于Thr394這個位于MEK2 C端的氨基酸殘基知之甚少,但在本實(shí)驗(yàn)中它在結(jié)直腸癌的發(fā)生過程中的明顯失表達(dá)的現(xiàn)象告訴我們,它可能是結(jié)直腸癌發(fā)生過程中的一個潛在保護(hù)因素。MEK2在Thr394的磷酸化值得我們進(jìn)一步深入研究。

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