彭 慧， 王道海， 胡 英， 王 磊， 黃美近， 劉煥亮， 汪建平△

(1中山大學(xué)附屬第六醫(yī)院結(jié)直腸外科，2中山大學(xué)胃腸病研究所，廣東廣州510655;

3河南省腫瘤醫(yī)院普外科，河南鄭州450008;4中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院特診中心，廣東廣州510080)

結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)的形成和發(fā)展是一個(gè)多因素多階段的復(fù)雜病理過(guò)程，其涉及到腸上皮細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、逃避反應(yīng)機(jī)制，而這些機(jī)制均由細(xì)胞內(nèi)外的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑所調(diào)控。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的異常往往導(dǎo)致細(xì)胞增殖和凋亡失控，與結(jié)直腸癌的發(fā)生密切相關(guān)［1-2］。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activaited protein kinase，MAPK)通路是細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要途徑，可以將多種細(xì)胞外信號(hào)通過(guò)磷酸化活化逐級(jí)傳遞至細(xì)胞內(nèi)，參與細(xì)胞生長(zhǎng)、分裂、分化及凋亡等多種生理過(guò)程，并在細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化中起重要作用［3-6］。MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子——絲裂原細(xì)胞外激酶1/2(mitogen extracellular kinase 1/2，MEK1/2)可被多種炎癥因子、生長(zhǎng)因子和環(huán)境應(yīng)激反應(yīng)等通過(guò)磷酸化而激活，從而產(chǎn)生不同的生物學(xué)效應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)MEK1/2的多個(gè)磷酸化位點(diǎn)的生物學(xué)效應(yīng)與結(jié)直腸癌的發(fā)生相關(guān)［5-6］，但MEK2蛋白第394位點(diǎn)蘇氨酸(Thr394)的磷酸化及其在人結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中的影響卻鮮有報(bào)道。

本研究旨在通過(guò)組織芯片-免疫組織化學(xué)的方法檢測(cè)Thr394磷酸化的MEK2［p-MEK2(Thr394)］蛋白在結(jié)直腸癌、結(jié)直腸腺瘤和結(jié)直腸旁正常上皮組織中的表達(dá)情況，并進(jìn)一步分析其與結(jié)直腸腺癌臨床病理參數(shù)及預(yù)后的關(guān)系，初步探討 p-MEK2(Thr394)在結(jié)直腸腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用及臨床意義。

材料和方法

1 材料

本研究共收集2組樣本。第1組:隨機(jī)收集2007年5月～2010年12月間中山大學(xué)附屬第六醫(yī)院結(jié)直腸癌病例組織石蠟包埋標(biāo)本144例，其中結(jié)直腸腺癌組織96例，結(jié)直腸腺瘤組織24例，癌旁正常組織(距離腫瘤邊緣5 cm以上)24例，所有病例切片均獲病理診斷確認(rèn)。第2組:隨機(jī)收集2000年1月～2005年12月間中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院收治的結(jié)直腸癌病例417例，均具備完整臨床病理參數(shù)和預(yù)后資料。成功取樣并有染色結(jié)果的病例為337例，均經(jīng)病理組織學(xué)證實(shí)?；颊哳A(yù)后隨訪方式:查閱病歷資料;定期電話詢問(wèn)或通信;家庭訪視。隨訪日期為自首次手術(shù)日期開(kāi)始起，每3個(gè)月隨訪1次。生存時(shí)間自首次手術(shù)之日起計(jì)算，隨訪終點(diǎn)為患者死亡日期或末次隨訪日期，隨訪截止時(shí)間為2010年8月31日，生存期以月為單位計(jì)算。剔除失訪患者后剩余341例納入生存分析。本研究獲中山大學(xué)倫理委員會(huì)同意，所有參加人員均知情同意。兔抗人p-MEK2(Thr394)單克隆抗體購(gòu)自Santa Cruz，抗體編號(hào)bs5427R。

2 方法

2．1 組織芯片制備 使用切片石蠟制備27 mm×22 mm×10 mm的受體蠟塊，并于蠟塊構(gòu)建12×8共96點(diǎn)組織陣列，2個(gè)相鄰樣本間距為1 mm。由資深病理科醫(yī)生在40倍顯微鏡像下確認(rèn)并定位標(biāo)記供體組織蠟塊，用組織芯片制作儀(Alphelys)穿取直徑1．0 mm供體組織放入受體蠟塊中，每一標(biāo)本選取2個(gè)位點(diǎn)。用石蠟切片機(jī)對(duì)組織芯片蠟塊進(jìn)行連續(xù)切片，厚度為4μm。

2．2 免疫組織化學(xué)法檢測(cè) 采用EnVision染色法檢測(cè)p-MEK2(Thr394)在各組織中的表達(dá)部位及強(qiáng)度。主要步驟如下:常規(guī)脫蠟入水，玻片置3%H2O2中10 min，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution，PBS)沖洗3次，置檸檬酸鈉抗原修復(fù)液(pH=6．0)高溫20 min，PBS沖洗3次，加I抗并4℃恒溫過(guò)夜;PBS沖洗4次，加II抗HRP液37℃避光孵育1 h，PBS沖洗4次，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片，鏡檢。PBS代替I抗作為陰性對(duì)照，結(jié)直腸癌組織陽(yáng)性切片作為陽(yáng)性對(duì)照。

2．3 結(jié)果判讀及評(píng)分標(biāo)準(zhǔn) p-MEK2(Thr394)陽(yáng)性表達(dá)信號(hào)為細(xì)胞漿或細(xì)胞核中出現(xiàn)黃色物且其染色強(qiáng)度高于背景非特異染色者，或棕黃色顆粒沉淀。采用雙盲法閱片，根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)和著色強(qiáng)度綜合記分。陽(yáng)性細(xì)胞著色強(qiáng)度評(píng)分:0分為陰性(不顯色)，1分為弱(淺灰黃色)，2分為中(淡黃色)，3分為稍強(qiáng)(黃色)，4分為強(qiáng)(棕黃色)。陽(yáng)性細(xì)胞百分率:0分為無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞，1分為陽(yáng)性細(xì)胞 1% ～25%，2分為陽(yáng)性細(xì)胞26% ～50%，3分為陽(yáng)性細(xì)胞51% ～75%，4分為陽(yáng)性細(xì)胞76% ～100%。結(jié)果判讀采用半定量積分分級(jí):積分=染色強(qiáng)度×染色細(xì)胞比例。當(dāng)同一標(biāo)本的2個(gè)組織芯片評(píng)分結(jié)果不一致時(shí)，取兩者的平均值。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS18．0統(tǒng)計(jì)軟件處理。應(yīng)用χ2檢驗(yàn)分析p-MEK2(Thr394)在不同組織中的陽(yáng)性表達(dá)差異及其與各項(xiàng)臨床參數(shù)的相關(guān)性。采用Kaplan-Meier方法分析p-MEK2(Thr394)表達(dá)與結(jié)直腸癌患者生存的相關(guān)性。以P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 p-MEK2(Thr394)蛋白的表達(dá)情況

p-MEK2(Thr394)蛋白在癌旁正常黏膜和腺瘤組織中表達(dá)均位于胞漿，未見(jiàn)明顯胞核染色。在腺癌組織中有4例表達(dá)位于胞核和胞漿，剩余陽(yáng)性表達(dá)者均位于胞核，見(jiàn)圖1。根據(jù)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，在本組144例標(biāo)本中，p-MEK2表達(dá)的平均值為7．36，以≥7分定義為高表達(dá)、＜7分為低表達(dá)分為2組。24例癌旁正常黏膜標(biāo)本均為高表達(dá)(100%)，未見(jiàn)低表達(dá)(0%)，平均值 15．41;24例腺瘤標(biāo)本中，平均值7.66，16 例高表達(dá)(66.7%)，8 例低表達(dá)(33.3%)。96例腺癌標(biāo)本中，表達(dá)平均值3.83，19例高表達(dá)(19.8%)，77例低表達(dá)(80.2%)。經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:三者總體比較有顯著差異(χ2=58．93，P ＜0.01)。p-MEK2在癌旁正常組織中的表達(dá)明顯高于結(jié)直腸腺瘤組織(χ2=9．60，P ＜0．05)，也明顯高于結(jié)直腸癌組織(χ2=53．72，P ＜0．01)，在結(jié)直腸腺瘤組織中表達(dá)明顯高于癌組織(χ2=20．42，P ＜0．01)，見(jiàn)表1。96例CRC中的p-MEK2(Thr394)的異常表達(dá)與各臨床病例參數(shù)之間均無(wú)相關(guān)性，見(jiàn)表2。

Figure 1．Immunohistochemical staining of colorsctal cancer tissues for p-MEK2(×400)．A:negative(0 score);B:positive(1score，yellowish gray);C:positive(2 score，pale yellow);D:positive(3 score，yellow);E:positive(4 score，brown)．圖1 p-MEK2在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)

表1 p-MEK2(Thr394)在結(jié)直腸正常黏膜、腺瘤和腺癌中的表達(dá)Table 1．p-MEK2(Thr394)expression in normal mucosa，adenoma，adenocarcinoma of colorectum

2 第2組樣本中p-MEK2(Thr394)蛋白的表達(dá)情況

第2組結(jié)直腸癌標(biāo)本組中，成功取樣并且有染色結(jié)果的共337例，表達(dá)的平均值為4．36。以＞4分定義為高表達(dá)，≤4分為低表達(dá)，共分為2組，其中203 例低表達(dá)(60．2%)，134 例高表達(dá)(39．8%)。p-MEK2與性別、年齡、大體分型、組織分型、分化程度、TNM分期等參數(shù)均無(wú)明顯相關(guān)性(P＞0．05)，見(jiàn)表3。

表2 第1組病例中p-MEK2(Thr394)表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系Table 2．The relationships between the expression of p-MEK2(Thr394)and the clinicopathological characteristics in the first group

3 p-MEK2的表達(dá)同結(jié)直腸癌預(yù)后的相關(guān)性

Kaplan-Meier分析表明，p-MEK2的表達(dá)同結(jié)直腸癌患者5年生存率無(wú)明顯相關(guān)性，log-rank檢驗(yàn)P ＞0．05，見(jiàn)圖2。

4 p-MEK2在胞漿及胞核中的表達(dá)

在第2組結(jié)直腸癌標(biāo)本中，p-MEK2也存在胞漿及胞核中同時(shí)表達(dá)的現(xiàn)象。合并2組結(jié)直腸癌標(biāo)本數(shù)據(jù)，共有24例(5．6%)標(biāo)本存在漿核陽(yáng)性。比較胞漿表達(dá)與胞漿胞核同時(shí)表達(dá)，2組的臨床病理參數(shù)及預(yù)后均無(wú)顯著差異(P＞0．05)，見(jiàn)表4。

討 論

作為MAPK信號(hào)通路的最下游，ERK1/2蛋白的活性范圍及持續(xù)時(shí)間，是細(xì)胞對(duì)外來(lái)刺激反應(yīng)的重要決定因素。在細(xì)胞內(nèi)存在著多種關(guān)鍵調(diào)節(jié)機(jī)制，來(lái)維持ERK1/2蛋白的激活與失活之間的平衡。這種平衡對(duì)于維持細(xì)胞正常的增殖、分化及凋亡，起著重要的作用。ERK1/2蛋白激酶的失活主要靠去磷酸化已被磷酸化的蘇氨酸和(或)絲氨酸來(lái)完成。生物學(xué)和基因?qū)W的研究表明，有活性的ERK1/2蛋白可以在體內(nèi)被特異性的酪氨酸磷酸酶和雙特異性MAPK磷酸酶失活，從而起到負(fù)性調(diào)節(jié)ERK1/2和其它MAPK蛋白激酶的活性［7-9］。但是，關(guān)于 ERK MAPK通路本身各級(jí)激酶對(duì)ERK1/2活性影響的卻大多數(shù)集中在正性調(diào)節(jié)上。

MEK1/2作為ERK MAPK通路的中心組成部分，同時(shí)也是目前已知僅有的2個(gè)ERK1/2蛋白激活酶，是我們目前研究腫瘤靶向治療的又一熱門(mén)潛在靶點(diǎn)。抑制MEK1/2可以通過(guò)阻斷異常的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，抑制腫瘤細(xì)胞的分化、增殖。這種抑制同時(shí)還有不受上游異常癌基因(K-ras和BRAF突變)影響的優(yōu)點(diǎn)。現(xiàn)在已有多種 MEK抑制劑進(jìn)入臨床試驗(yàn)［10-11］。目前關(guān)于MEK1/2蛋白與腫瘤的發(fā)病機(jī)制的研究只集中于激酶領(lǐng)域，存在于MEK2蛋白C末端第394位的蘇氨酸殘基卻從未被報(bào)道過(guò)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)免疫組化的實(shí)驗(yàn)方法將p-MEK2蛋白的表達(dá)狀況與結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展的不同階段聯(lián)系起來(lái)，研究Thr394位點(diǎn)磷酸化在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用。

近年來(lái)的研究表明，MAPK信號(hào)通路在結(jié)直腸癌的形成中大都處于異常激活狀態(tài)［12］。Deng等［13］通過(guò)對(duì)123例結(jié)直腸癌的免疫組化研究發(fā)現(xiàn)，激活狀態(tài)的MEK1/2在76%(93例)結(jié)直腸癌中高表達(dá)，而在正常腸上皮組織中只有很弱的表達(dá)，或者不表達(dá)。這恰恰與p-MEK2(Thr394)的表達(dá)呈相反趨勢(shì)。本研究檢測(cè)p-MEK2(Thr394)在結(jié)直腸正常上皮組織、腺瘤和腺癌組織中的表達(dá)情況，其表達(dá)呈明顯的遞減趨勢(shì)，高表達(dá)率分別為100%、66．7%和19.8%。統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果顯示三者總體比較具有顯著差異(P＜0．01);三者的兩兩比較也具有顯著差異。二者這種截然不同的表達(dá)結(jié)果提示我們:在結(jié)直腸癌的發(fā)展過(guò)程中，MEK2第394位點(diǎn)蘇氨酸殘基的磷酸化，在某種意義上可以作為一種保護(hù)因素，抑制癌癥的發(fā)生。正是這種抑癌因素與促癌因素(MEK1/2異常激活)之間的平衡被打破，正常的腸上皮細(xì)胞開(kāi)始向腫瘤轉(zhuǎn)化。

表3 p-MEK2的表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系Table 3．The relationships between the expression of p-MEK2(Thr394)and the clinicopathological characteristic in colorectal carcinoma

Figure 2．Kaplan-Meier analysis of association between p-MEK2 expression and survival rate of colorectal cancer patients．圖2 p-MEK2的表達(dá)水平與結(jié)直腸癌患者5年生存率的關(guān)系

表4 p-MEK2在2組腺癌標(biāo)本胞漿、胞核中的陽(yáng)性表達(dá)Table 4．The positive expression of p-MEK2(Thr394)in the cytoplasm and nucleus of adenocarcinoma samples

本研究另外一個(gè)目的是研究p-MEK2(Thr394)蛋白表達(dá)與結(jié)直腸癌患者的各種臨床參數(shù)及預(yù)后的相關(guān)性。通過(guò)不同的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，我們發(fā)現(xiàn)，p-MEK2(Thr394)蛋白的表達(dá)與結(jié)直腸癌的各種臨床參數(shù)(如年齡、性別、分化程度、分期)以及預(yù)后均無(wú)明顯相關(guān)性，這個(gè)結(jié)果提示我們，p-MEK2(Thr394)的失表達(dá)可能對(duì)腫瘤的發(fā)生階段起著重要的調(diào)控作用，但在腫瘤的進(jìn)展過(guò)程中，其下游其它因子的作用更大。

本研究同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，在 2組的 p-MEK2(Thr394)陽(yáng)性表達(dá)的結(jié)直腸癌標(biāo)本(共300例)中，44例同時(shí)存在于胞漿及胞核中。激活狀態(tài)的MEK1/2可以在胞漿及胞核中表達(dá)，這種現(xiàn)象已經(jīng)在Deng等［13］的實(shí)驗(yàn)中得到證實(shí)。Georgieva 等［14］則對(duì)其機(jī)制和作用進(jìn)行了研究。他們的研究表明，激活狀態(tài)的MEK1/2可以自由地進(jìn)出于胞漿及胞核之間。MEK1/2進(jìn)入胞核主要靠被動(dòng)擴(kuò)散機(jī)制，它由胞核進(jìn)入到胞漿則是靠其位于蛋白N端的一個(gè)短的富含亮氨酸的信號(hào)肽。這條肽鏈又稱核轉(zhuǎn)出信號(hào)肽(nuclear export signal，NES)，它位于 MEK1/2 蛋白的第31號(hào)氨基酸殘基到第51號(hào)殘基之間。NES信號(hào)肽的存在使得MEK1/2可以以主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)的形式回到胞漿，正是這種主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)使得與MEK1/2結(jié)合的ERK1/2可以在胞漿重新定位，這也是目前我們已知的唯一一個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn) ERK1/2出胞核的途徑［15］。p-MEK2(Thr394)蛋白也存在N端的NES肽段，它在細(xì)胞核中的表達(dá)提示，Thr394的磷酸化也可能存在對(duì)ERK1/2重新定位的調(diào)節(jié)。

盡管目前我們對(duì)于Thr394這個(gè)位于MEK2 C端的氨基酸殘基知之甚少，但在本實(shí)驗(yàn)中它在結(jié)直腸癌的發(fā)生過(guò)程中的明顯失表達(dá)的現(xiàn)象告訴我們，它可能是結(jié)直腸癌發(fā)生過(guò)程中的一個(gè)潛在保護(hù)因素。MEK2在Thr394的磷酸化值得我們進(jìn)一步深入研究。