王海燕, 鄒正渝, 段 亮, 陳 嫻, 李 歡, 袁世梅, 何通川, 周 蘭
(重慶醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,重慶400016)
骨肉瘤是最常見的原發(fā)性惡性腫瘤之一,發(fā)病年齡多在15~25歲之間,惡性程度較高,極易出現(xiàn)轉(zhuǎn)移,預(yù)后極差,其發(fā)病原因和發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚。目前骨肉瘤的治療采取以手術(shù)為主的綜合治療,截肢后3~5年的存活率僅為5% ~20%左右。因此,研究骨肉瘤的發(fā)病機(jī)制,為臨床早期診斷、治療以及預(yù)后提供可靠依據(jù)。
S100A6屬于S100蛋白家族成員,分子量約為10 kD,能與游離鈣離子或者靶蛋白結(jié)合后發(fā)揮多種生物學(xué)作用,如參與細(xì)胞的增殖與凋亡、調(diào)節(jié)酶活性、維持胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài),蛋白質(zhì)的磷酸化等。大量文獻(xiàn)報(bào)道其在骨肉瘤[1]、胃癌[2]等腫瘤組織中表達(dá)異常,其作用機(jī)制尚未完全明確。本課題組前期成功制備了有活性的重組人S100A6蛋白(recombinant human S100A6,rhS100A6),外 源 性 地 加 入 30 mg/L rhS100A6能夠顯著增強(qiáng)人骨肉瘤細(xì)胞143B的增殖、遷移及侵襲能力,并且明顯上調(diào)143B細(xì)胞中β-catenin的水平,而對(duì)143B細(xì)胞的凋亡沒有明顯影響[3]。
磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B,PI3K/Akt)信號(hào)途徑是近年來發(fā)現(xiàn)的一條重要的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,參與細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化等多個(gè)過程,在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。LY294002和wortmannin是PI3K抑制劑,可以通透細(xì)胞特異性阻斷PI3K/Akt信號(hào)通路,抑制Akt磷酸化。S100A6對(duì)143B細(xì)胞是否可以通過調(diào)節(jié)PI3K/Akt信號(hào)途徑發(fā)揮作用,目前尚未報(bào)道。本課題聯(lián)合rhS100A6與PI3K抑制劑LY294002或wortmannin處理143B細(xì)胞,旨在探討PI3K/Akt信號(hào)途徑在S100A6誘導(dǎo)的143B細(xì)胞的增殖和遷移中的作用。
人骨肉瘤細(xì)胞143B由美國(guó)芝加哥大學(xué)醫(yī)學(xué)中心分子腫瘤研究室饋贈(zèng)。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自HyClone。重組質(zhì)粒 pGST-HRV3C、pGST-ClvHRV3C-hS100A6和感受態(tài)細(xì)菌E.coli BL21為本實(shí)驗(yàn)室保存。LY294002購(gòu)自CST。Wortmannin購(gòu)自Sigma。鼠抗人S100A6單克隆抗體、鼠抗人β-actin單克隆抗體購(gòu)自Santa Cruz。兔抗人Akt多克隆抗體、兔抗人p-Akt(Ser473)多克隆抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG和辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體購(gòu)自CST?;瘜W(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)自Pierce。PVDF膜和Millicell細(xì)胞培養(yǎng)小室購(gòu)自Millipore。MTT購(gòu)自Sigma。結(jié)晶紫購(gòu)自溫州東升化工公司。
2.1 rhS100A6的制備 rhS100A6制備的方法參考文獻(xiàn)[3]。分別將重組質(zhì)粒 pGST-HRV3C和 pGSTClvHRV3C-hS100A6轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)菌E.coli BL21中,在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)擴(kuò)增,加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactoside,IPTG)誘導(dǎo)表達(dá)蛋白,分別表達(dá)重組蛋白谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶-人鼻病毒3C蛋白酶(glutathione S transferase-human rhinovirus 3C protease,GST-HRV3C)和重組蛋白谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶-人鼻病毒3C蛋白酶酶切序列-hS100A6(glutathione S transferase-human rhinovirus 3C protease cleavage site-hS100A6,GST-ClvHRV3C-hS100A6),超聲破菌后,谷胱甘肽-瓊脂糖4B球珠(glutathione sepharose 4B,GS4B)純化,GST-HRV3C酶切GST-ClvHRV3C-hS100A6,經(jīng)GS4B純化,即為rhS100A6蛋白,行SDS-PAGE(考馬斯亮藍(lán)染色)和Western blotting鑒定,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>
2.2 細(xì)胞培養(yǎng)和分組 人骨肉瘤細(xì)胞143B培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中,置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),實(shí)驗(yàn)分組為:空白組、rhS100A6(30 mg/L)組、rhS100A6(30 mg/L)+LY294002(10 μmol/L)組、rhS100A6(30 mg/L)+wortmannin(0.5 μmol/L)組、LY294002(10 μmol/L)組和wortmannin(0.5μmol/L)組。
2.3 Western blotting檢測(cè)細(xì)胞中 t-Akt和 p-Akt的蛋白水平 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞,待細(xì)胞融合度達(dá)到50%左右時(shí)更換為1%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基,進(jìn)行實(shí)驗(yàn)干預(yù),分組同上,于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),此時(shí)記為0 h。48 h后加入細(xì)胞裂解液后提取細(xì)胞總蛋白,分光光度儀測(cè)定其濃度。蛋白煮沸變性,經(jīng)10%SDS-PAGE電泳后,轉(zhuǎn)移至PVDF膜,5%BSA封閉2 h,加Ⅰ抗(1∶1 000稀釋)4℃孵育過夜,0.1%TBST洗滌,加Ⅱ抗(1∶5 000稀釋)37℃ 孵育1 h,0.1%TBST洗滌,按照電化學(xué)發(fā)光試劑盒說明對(duì)其顯色,用凝膠成像儀與Quantity One軟件采集圖像,并對(duì)其分析。
2.4 MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞,用DMEM完全培養(yǎng)基稀釋至約1×107cells/L,于96孔板中每孔接種200μL,于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。12 h后更換為1%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基,進(jìn)行實(shí)驗(yàn)干預(yù),分組同上,均設(shè)5個(gè)復(fù)孔,此時(shí)記為0 h。于1~4 d后每孔內(nèi)加入20μL MTT,繼續(xù)孵育4 h,棄上清,每孔加200μL DMSO,測(cè)492 nm處吸光度值,以均值為縱坐標(biāo),時(shí)間為橫坐標(biāo),描繪細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。
2.5 Transwell檢測(cè)細(xì)胞遷移 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞,用無血清 DMEM培養(yǎng)基稀釋至1×108cells/L,取400μL加入到Transwell上室內(nèi),下室加入600μL 20%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基,于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),此時(shí)記為0 h。24 h后將小室取出,PBS洗凈,置于無水乙醇中固定20 min,于結(jié)晶紫中染色20 min,PBS洗凈,待小室風(fēng)干,倒置顯微鏡下觀察并對(duì)各組穿膜細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。
數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示,采用t檢驗(yàn)比較兩組間差異的顯著性,用SPSS 16.0軟件包分析,以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
將rhS100A6經(jīng)SDS-PAGE后考馬斯亮藍(lán)染色,Western blotting加以鑒定,結(jié)果顯示,制備的rhS100A6分子量正確,見圖1A;相比PBS陰性對(duì)照組,制備的rhS100A6蛋白能與鼠抗人S100A6單克隆抗體發(fā)生特異反應(yīng),見圖1B;證實(shí)rhS100A6蛋白成功制備。
Figure 1.Identification of rhS100A6.A:SDS-PAGE;B:Western blotting.圖1 rhS100A6的鑒定
隨之,30 mg/L rhS100A6處理143B細(xì)胞特定時(shí)間后,MTT增殖實(shí)驗(yàn)和 Transwell遷移實(shí)驗(yàn)顯示rhS100A6顯著增強(qiáng)143B細(xì)胞的增殖(見圖4 rhS100A6 group)和遷移能力(見圖 5 rhS100A6 group),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
30 mg/L rhS100A6作用143B細(xì)胞48 h后,Western blotting結(jié)果顯示,空白組p-Akt的校正灰度值為0.35±0.03,rhS100A6組p-Akt的校正灰度值為0.67±0.02,rhS100A6組較空白組增加91.4%(P<0.05),而兩組的t-Akt校正灰度值之間則無明顯差異(P>0.05),見圖2。結(jié)果提示rhS100A6能夠促進(jìn)Akt的磷酸化,即激活PI3K/Akt信號(hào)通路。
聯(lián)合rhS100A6和PI3K抑制劑LY294002或wortmannin處理143B細(xì)胞48 h后,Western blotting結(jié)果顯示,空白組 p-Akt的校正灰度值為0.38±0.02,rhS100A6組 p-Akt的校正灰度值為 0.96±0.05,rhS100A6組較空白組增加 263.1%(P<0.05);rhS100A6+LY294002聯(lián)合處理組p-Akt的校正灰度值為0.56±0.03,較rhS100A6組減少44.7%(P<0.05);而rhS100A6+wortmannin聯(lián)合處理組的校正灰度值為 0.45±0.03,較 rhS100A6組減少53.1%(P<0.05),見圖3。結(jié)果提示PI3K抑制劑LY294002和wortmannin均能夠部分逆轉(zhuǎn)rhS100A6誘導(dǎo)的143B細(xì)胞中磷酸化Akt的上調(diào)。
聯(lián)合rhS100A6和PI3K抑制劑LY294002或wortmannin處理143B細(xì)胞1~4 d后,MTT結(jié)果顯示,在處理1~4 d后空白組的A492值分別為0.256±0.033、0.303±0.059、0.326±0.084和 0.318±0.061,rhS100A6組的 A492值分別為0.288±0.025、0.467±0.035、0.589±0.068和 0.623±0.031,rhS100A6組較空白組分別增加12.5%、54.1%、80.7%和95.9%(P<0.05);而rhS100A6+LY294002聯(lián)合處理組的A492值分別為0.284±0.042、0.402±0.073、0.461±0.031和 0.474±0.026,較 rhS100A6組分別減少10.3%、23.9%、31.7%和58.4%(P<0.05);rhS100A6+wortmannin聯(lián)合處理組的A492值分別為0.267±0.042、0.356±0.073、0.393±0.031和0.414±0.026,較rhS100A6組分別減少17.2%、28.3%、44.5%和69.7%(P<0.05),見圖4。結(jié)果提示PI3K抑制劑LY294002和wortmannin均能夠部分逆轉(zhuǎn)rhS100A6對(duì)143B細(xì)胞的促增殖作用。
聯(lián)合rhS100A6和PI3K抑制劑LY294002或wortmannin處理143B細(xì)胞24 h后,Transwell遷移結(jié)果顯示,空白組穿過的細(xì)胞數(shù)為32±3,rhS100A6組穿過的細(xì)胞數(shù)為86±4,rhS100A6組較空白組增加168.8%(P<0.05);rhS100A6+LY294002聯(lián)合處理組穿過的細(xì)胞數(shù)為57±5,較rhS100A6組減少37.9%(P<0.05);rhS100A6+wortmannin聯(lián)合處理組穿過的細(xì)胞數(shù)為52±4,較 rhS100A6組減少41.6%(P<0.05),見圖5。結(jié)果提示PI3K抑制劑LY294002和wortmannin均能夠部分逆轉(zhuǎn)rhS100A6對(duì)143B細(xì)胞的促遷移作用。
Figure 3.The effects of LY294002 and wortmannin on rhS100A6-induced phosphorylation of Akt in 143B cells detected by Western blotting.Mean±SD.n=3.*P <0.05 vs blank group;#P <0.05 vs rhS100A6 group.圖3 LY294002和wortmannin對(duì)rhS100A6誘導(dǎo)的143B細(xì)胞Akt磷酸化的影響
Figure 4.The effects of LY294002 and wortmannin on rhS100A6-induced proliferation of 143B cells detected by MTT assay.Mean ± SD.n=3.*P <0.05 vs blank group;#P <0.05 vs rhS100A6 group.圖4 LY294002和wortmannin對(duì)rhS100A6誘導(dǎo)的143B細(xì)胞增殖活性的影響
S100A6 由 Kuznicki等[4]首次在 Ehrlich 腹水瘤中發(fā)現(xiàn),屬于S100鈣離子結(jié)合蛋白家族,具有EF手型結(jié)構(gòu),分子量約為10 kD。當(dāng)它結(jié)合鈣離子后隨即發(fā)生蛋白構(gòu)象的改變,使其經(jīng)典的EF手型結(jié)構(gòu)得以暴露,該EF手型結(jié)構(gòu)可以與多種靶蛋白結(jié)合,如原肌球蛋白、CacyBP/SIP及某些膜連蛋白等[5]。Wei等[6]應(yīng)用質(zhì)譜分析在小鼠乳腺癌模型中發(fā)現(xiàn)血清中S100A6的量與腫瘤的發(fā)生發(fā)展呈正相關(guān);Wang等[7]發(fā)現(xiàn)胃癌中S100A6的過度表達(dá)與病人的預(yù)后不良有關(guān);Ilg等[8]在研究中發(fā)現(xiàn)在腫瘤邊緣多有S100A6的異常表達(dá),提示其可能與腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移關(guān)系密切;Luo等[9]發(fā)現(xiàn)人骨肉瘤組織中存在S100A6的過度表達(dá),其作用尚存爭(zhēng)議。本課題組前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明S100A6能促進(jìn)人骨肉瘤細(xì)胞系143B的增殖及遷移侵襲[3],關(guān)于S100A6對(duì)人骨肉瘤的具體作用機(jī)制尚未報(bào)道。PI3K/Akt途徑是近年來發(fā)現(xiàn)的一條重要的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。研究表明,在多種腫瘤組織,如骨肉瘤[10]、胃腸道腫瘤[11]、乳腺癌和前列腺癌[12]等癌組織中均有Akt的過度表達(dá)及活化,Akt的活化能磷酸化多種下游靶分子,如Bcl-2家族、糖原合成酶激酶3(GSK3)和S6蛋白激酶等,對(duì)細(xì)胞的生存、凋亡和動(dòng)力等有重要影響。Gao等[13]發(fā)現(xiàn)在卵巢癌細(xì)胞中通過激活PI3K/Akt/mTOR/p70S6K1信號(hào)通路可增加cyclins的表達(dá),促進(jìn)G1期發(fā)展,促進(jìn)細(xì)胞增殖與分化。Grille等[14]發(fā)現(xiàn)AKT可通過誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化促進(jìn)鱗狀癌細(xì)胞系的動(dòng)力和侵襲;maseki等[15]發(fā)現(xiàn)Akt/GSK3β/snail信號(hào)通路可介導(dǎo)頭頸鱗狀癌細(xì)胞系的增殖與動(dòng)力;龐瑞萍等[16]發(fā)現(xiàn)吲哚美辛可通過激活A(yù)kt/GSK3β/NAG-1信號(hào)通路誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞的凋亡。在骨肉瘤治療方面,某些抗腫瘤藥物也可通過PI3K/Akt信號(hào)途徑抑制骨肉瘤的生長(zhǎng)和發(fā)展,比如松弛素可通過PI3K/Akt/VEGF通路促進(jìn)Saos-2細(xì)胞的生長(zhǎng)、侵襲以及血管發(fā)生[17],木黃酮可通過下調(diào)PI3K/Akt信號(hào)通路從而增強(qiáng)吉西他濱對(duì)骨肉瘤的抗癌效應(yīng)[18]。上述研究提示PI3K/Akt信號(hào)通路的激活對(duì)骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展具有重要的作用。
Figure 5.The effects of LY294002 and wortmannin on rhS100A6-induced migration of 143B cells detected by Transwell assay.Mean ±SD.n=3.*P <0.05 vs blank group;#P <0.05 vs rhS100A6 group.圖5 LY294002和wortmannin對(duì)rhS100A6誘導(dǎo)的143B細(xì)胞遷移活性的影響
基于上述研究,本研究擬探明S100A6對(duì)骨肉瘤的作用是否經(jīng)由該途徑。結(jié)果表明,rhS100A6在顯著增強(qiáng)人骨肉瘤細(xì)胞143B的增殖和遷移能力的同時(shí),也能夠上調(diào)Akt的磷酸化,提示PI3K/Akt信號(hào)通路的激活可能參與介導(dǎo)rhS100A6對(duì)143B細(xì)胞的促增殖和遷移作用。隨之,我們應(yīng)用 PI3K抑制劑LY294002或wortmannin來驗(yàn)證我們的假設(shè),實(shí)驗(yàn)結(jié)果與預(yù)期相符,即LY294002和wortmannin均在明顯逆轉(zhuǎn)rhS100A6誘導(dǎo)的143B細(xì)胞中Akt磷酸化的上調(diào)作用的同時(shí),也逆轉(zhuǎn)其對(duì)143B細(xì)胞的促細(xì)胞增殖和遷移的作用。所以我們認(rèn)為S100A6對(duì)人骨肉瘤細(xì)胞143B的促增殖與遷移作用至少部分是通過激活PI3K/Akt信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。
綜上所述,本研究在一定程度上揭示了在S100A6介導(dǎo)的促人骨肉瘤細(xì)胞143B增殖及遷移的作用中PI3K/Akt信號(hào)通路的參與,為進(jìn)一步闡明S100A6對(duì)骨肉瘤的作用及機(jī)制、甚至骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù),也為骨肉瘤的治療研究提供了潛在的靶點(diǎn)。