王海燕， 鄒正渝， 段 亮， 陳 嫻， 李 歡， 袁世梅， 何通川， 周 蘭

(重慶醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶400016)

骨肉瘤是最常見的原發(fā)性惡性腫瘤之一，發(fā)病年齡多在15～25歲之間，惡性程度較高，極易出現(xiàn)轉(zhuǎn)移，預(yù)后極差，其發(fā)病原因和發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚。目前骨肉瘤的治療采取以手術(shù)為主的綜合治療，截肢后3～5年的存活率僅為5% ～20%左右。因此，研究骨肉瘤的發(fā)病機(jī)制，為臨床早期診斷、治療以及預(yù)后提供可靠依據(jù)。

S100A6屬于S100蛋白家族成員，分子量約為10 kD，能與游離鈣離子或者靶蛋白結(jié)合后發(fā)揮多種生物學(xué)作用，如參與細(xì)胞的增殖與凋亡、調(diào)節(jié)酶活性、維持胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)，蛋白質(zhì)的磷酸化等。大量文獻(xiàn)報(bào)道其在骨肉瘤［1］、胃癌［2］等腫瘤組織中表達(dá)異常，其作用機(jī)制尚未完全明確。本課題組前期成功制備了有活性的重組人S100A6蛋白(recombinant human S100A6，rhS100A6)，外 源 性 地 加 入 30 mg/L rhS100A6能夠顯著增強(qiáng)人骨肉瘤細(xì)胞143B的增殖、遷移及侵襲能力，并且明顯上調(diào)143B細(xì)胞中β-catenin的水平，而對(duì)143B細(xì)胞的凋亡沒(méi)有明顯影響［3］。

磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B，PI3K/Akt)信號(hào)途徑是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一條重要的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，參與細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化等多個(gè)過(guò)程，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。LY294002和wortmannin是PI3K抑制劑，可以通透細(xì)胞特異性阻斷PI3K/Akt信號(hào)通路，抑制Akt磷酸化。S100A6對(duì)143B細(xì)胞是否可以通過(guò)調(diào)節(jié)PI3K/Akt信號(hào)途徑發(fā)揮作用，目前尚未報(bào)道。本課題聯(lián)合rhS100A6與PI3K抑制劑LY294002或wortmannin處理143B細(xì)胞，旨在探討PI3K/Akt信號(hào)途徑在S100A6誘導(dǎo)的143B細(xì)胞的增殖和遷移中的作用。

材料和方法

1 細(xì)胞與試劑

人骨肉瘤細(xì)胞143B由美國(guó)芝加哥大學(xué)醫(yī)學(xué)中心分子腫瘤研究室饋贈(zèng)。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自HyClone。重組質(zhì)粒 pGST-HRV3C、pGST-ClvHRV3C-hS100A6和感受態(tài)細(xì)菌E．coli BL21為本實(shí)驗(yàn)室保存。LY294002購(gòu)自CST。Wortmannin購(gòu)自Sigma。鼠抗人S100A6單克隆抗體、鼠抗人β-actin單克隆抗體購(gòu)自Santa Cruz。兔抗人Akt多克隆抗體、兔抗人p-Akt(Ser473)多克隆抗體、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體購(gòu)自CST。化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)自Pierce。PVDF膜和Millicell細(xì)胞培養(yǎng)小室購(gòu)自Millipore。MTT購(gòu)自Sigma。結(jié)晶紫購(gòu)自溫州東升化工公司。

2 方法

2．1 rhS100A6的制備 rhS100A6制備的方法參考文獻(xiàn)［3］。分別將重組質(zhì)粒 pGST-HRV3C和 pGSTClvHRV3C-hS100A6轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)菌E．coli BL21中，在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)擴(kuò)增，加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactoside，IPTG)誘導(dǎo)表達(dá)蛋白，分別表達(dá)重組蛋白谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶－人鼻病毒3C蛋白酶(glutathione S transferase-human rhinovirus 3C protease，GST-HRV3C)和重組蛋白谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶－人鼻病毒3C蛋白酶酶切序列-hS100A6(glutathione S transferase-human rhinovirus 3C protease cleavage site-hS100A6，GST-ClvHRV3C-hS100A6)，超聲破菌后，谷胱甘肽－瓊脂糖4B球珠(glutathione sepharose 4B，GS4B)純化，GST-HRV3C酶切GST-ClvHRV3C-hS100A6，經(jīng)GS4B純化，即為rhS100A6蛋白，行SDS-PAGE(考馬斯亮藍(lán)染色)和Western blotting鑒定，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2．2 細(xì)胞培養(yǎng)和分組 人骨肉瘤細(xì)胞143B培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)分組為:空白組、rhS100A6(30 mg/L)組、rhS100A6(30 mg/L)+LY294002(10 μmol/L)組、rhS100A6(30 mg/L)+wortmannin(0.5 μmol/L)組、LY294002(10 μmol/L)組和wortmannin(0.5μmol/L)組。

2．3 Western blotting檢測(cè)細(xì)胞中 t-Akt和 p-Akt的蛋白水平 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，待細(xì)胞融合度達(dá)到50%左右時(shí)更換為1%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)干預(yù)，分組同上，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，此時(shí)記為0 h。48 h后加入細(xì)胞裂解液后提取細(xì)胞總蛋白，分光光度儀測(cè)定其濃度。蛋白煮沸變性，經(jīng)10%SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%BSA封閉2 h，加Ⅰ抗(1∶1 000稀釋)4℃孵育過(guò)夜，0.1%TBST洗滌，加Ⅱ抗(1∶5 000稀釋)37℃ 孵育1 h，0.1%TBST洗滌，按照電化學(xué)發(fā)光試劑盒說(shuō)明對(duì)其顯色，用凝膠成像儀與Quantity One軟件采集圖像，并對(duì)其分析。

2．4 MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用DMEM完全培養(yǎng)基稀釋至約1×107cells/L，于96孔板中每孔接種200μL，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。12 h后更換為1%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)干預(yù)，分組同上，均設(shè)5個(gè)復(fù)孔，此時(shí)記為0 h。于1～4 d后每孔內(nèi)加入20μL MTT，繼續(xù)孵育4 h，棄上清，每孔加200μL DMSO，測(cè)492 nm處吸光度值，以均值為縱坐標(biāo)，時(shí)間為橫坐標(biāo)，描繪細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

2．5 Transwell檢測(cè)細(xì)胞遷移 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用無(wú)血清 DMEM培養(yǎng)基稀釋至1×108cells/L，取400μL加入到Transwell上室內(nèi)，下室加入600μL 20%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，此時(shí)記為0 h。24 h后將小室取出，PBS洗凈，置于無(wú)水乙醇中固定20 min，于結(jié)晶紫中染色20 min，PBS洗凈，待小室風(fēng)干，倒置顯微鏡下觀察并對(duì)各組穿膜細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，采用t檢驗(yàn)比較兩組間差異的顯著性，用SPSS 16.0軟件包分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 制備的rhS100A6通過(guò)鑒定并具有促進(jìn)143B細(xì)胞增殖和遷移的活性

將rhS100A6經(jīng)SDS-PAGE后考馬斯亮藍(lán)染色，Western blotting加以鑒定，結(jié)果顯示，制備的rhS100A6分子量正確，見圖1A;相比PBS陰性對(duì)照組，制備的rhS100A6蛋白能與鼠抗人S100A6單克隆抗體發(fā)生特異反應(yīng)，見圖1B;證實(shí)rhS100A6蛋白成功制備。

Figure 1．Identification of rhS100A6．A:SDS-PAGE;B:Western blotting．圖1 rhS100A6的鑒定

隨之，30 mg/L rhS100A6處理143B細(xì)胞特定時(shí)間后，MTT增殖實(shí)驗(yàn)和 Transwell遷移實(shí)驗(yàn)顯示rhS100A6顯著增強(qiáng)143B細(xì)胞的增殖(見圖4 rhS100A6 group)和遷移能力(見圖 5 rhS100A6 group)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

2 rhS100A6促進(jìn)143B細(xì)胞中Akt的磷酸化

30 mg/L rhS100A6作用143B細(xì)胞48 h后，Western blotting結(jié)果顯示，空白組p-Akt的校正灰度值為0.35±0.03，rhS100A6組p-Akt的校正灰度值為0.67±0.02，rhS100A6組較空白組增加91.4%(P＜0.05)，而兩組的t-Akt校正灰度值之間則無(wú)明顯差異(P＞0.05)，見圖2。結(jié)果提示rhS100A6能夠促進(jìn)Akt的磷酸化，即激活PI3K/Akt信號(hào)通路。

3 LY294002和wortmannin均能夠部分逆轉(zhuǎn)rhS100A6誘導(dǎo)的143B細(xì)胞中磷酸化Akt的上調(diào)

聯(lián)合rhS100A6和PI3K抑制劑LY294002或wortmannin處理143B細(xì)胞48 h后，Western blotting結(jié)果顯示，空白組 p-Akt的校正灰度值為0.38±0.02，rhS100A6組 p-Akt的校正灰度值為 0.96±0.05，rhS100A6組較空白組增加 263.1%(P＜0.05);rhS100A6+LY294002聯(lián)合處理組p-Akt的校正灰度值為0.56±0.03，較rhS100A6組減少44.7%(P＜0.05);而rhS100A6+wortmannin聯(lián)合處理組的校正灰度值為 0.45±0.03，較 rhS100A6組減少53.1%(P＜0.05)，見圖3。結(jié)果提示PI3K抑制劑LY294002和wortmannin均能夠部分逆轉(zhuǎn)rhS100A6誘導(dǎo)的143B細(xì)胞中磷酸化Akt的上調(diào)。

4 LY294002和wortmannin均能夠部分逆轉(zhuǎn)rhS100A6對(duì)143B細(xì)胞的促增殖作用

聯(lián)合rhS100A6和PI3K抑制劑LY294002或wortmannin處理143B細(xì)胞1～4 d后，MTT結(jié)果顯示，在處理1～4 d后空白組的A492值分別為0.256±0.033、0.303±0.059、0.326±0.084和 0.318±0.061，rhS100A6組的 A492值分別為0.288±0.025、0.467±0.035、0.589±0.068和 0.623±0.031，rhS100A6組較空白組分別增加12.5%、54.1%、80.7%和95.9%(P＜0.05);而rhS100A6+LY294002聯(lián)合處理組的A492值分別為0.284±0.042、0.402±0.073、0.461±0.031和 0.474±0.026，較 rhS100A6組分別減少10.3%、23.9%、31.7%和58.4%(P＜0.05);rhS100A6+wortmannin聯(lián)合處理組的A492值分別為0.267±0.042、0.356±0.073、0.393±0.031和0.414±0.026，較rhS100A6組分別減少17.2%、28.3%、44.5%和69.7%(P＜0.05)，見圖4。結(jié)果提示PI3K抑制劑LY294002和wortmannin均能夠部分逆轉(zhuǎn)rhS100A6對(duì)143B細(xì)胞的促增殖作用。

5 LY294002和wortmannin均能夠部分逆轉(zhuǎn)rhS100A6對(duì)143B細(xì)胞的促遷移作用

聯(lián)合rhS100A6和PI3K抑制劑LY294002或wortmannin處理143B細(xì)胞24 h后，Transwell遷移結(jié)果顯示，空白組穿過(guò)的細(xì)胞數(shù)為32±3，rhS100A6組穿過(guò)的細(xì)胞數(shù)為86±4，rhS100A6組較空白組增加168.8%(P＜0.05);rhS100A6+LY294002聯(lián)合處理組穿過(guò)的細(xì)胞數(shù)為57±5，較rhS100A6組減少37.9%(P＜0.05);rhS100A6+wortmannin聯(lián)合處理組穿過(guò)的細(xì)胞數(shù)為52±4，較 rhS100A6組減少41.6%(P＜0.05)，見圖5。結(jié)果提示PI3K抑制劑LY294002和wortmannin均能夠部分逆轉(zhuǎn)rhS100A6對(duì)143B細(xì)胞的促遷移作用。

Figure 3．The effects of LY294002 and wortmannin on rhS100A6-induced phosphorylation of Akt in 143B cells detected by Western blotting．Mean±SD．n=3．*P ＜0.05 vs blank group;#P ＜0.05 vs rhS100A6 group．圖3 LY294002和wortmannin對(duì)rhS100A6誘導(dǎo)的143B細(xì)胞Akt磷酸化的影響

Figure 4．The effects of LY294002 and wortmannin on rhS100A6-induced proliferation of 143B cells detected by MTT assay．Mean ± SD．n=3．*P ＜0.05 vs blank group;#P ＜0.05 vs rhS100A6 group．圖4 LY294002和wortmannin對(duì)rhS100A6誘導(dǎo)的143B細(xì)胞增殖活性的影響

討 論

S100A6 由 Kuznicki等［4］首次在 Ehrlich 腹水瘤中發(fā)現(xiàn)，屬于S100鈣離子結(jié)合蛋白家族，具有EF手型結(jié)構(gòu)，分子量約為10 kD。當(dāng)它結(jié)合鈣離子后隨即發(fā)生蛋白構(gòu)象的改變，使其經(jīng)典的EF手型結(jié)構(gòu)得以暴露，該EF手型結(jié)構(gòu)可以與多種靶蛋白結(jié)合，如原肌球蛋白、CacyBP/SIP及某些膜連蛋白等［5］。Wei等［6］應(yīng)用質(zhì)譜分析在小鼠乳腺癌模型中發(fā)現(xiàn)血清中S100A6的量與腫瘤的發(fā)生發(fā)展呈正相關(guān);Wang等［7］發(fā)現(xiàn)胃癌中S100A6的過(guò)度表達(dá)與病人的預(yù)后不良有關(guān);Ilg等［8］在研究中發(fā)現(xiàn)在腫瘤邊緣多有S100A6的異常表達(dá)，提示其可能與腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移關(guān)系密切;Luo等［9］發(fā)現(xiàn)人骨肉瘤組織中存在S100A6的過(guò)度表達(dá)，其作用尚存爭(zhēng)議。本課題組前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明S100A6能促進(jìn)人骨肉瘤細(xì)胞系143B的增殖及遷移侵襲［3］，關(guān)于S100A6對(duì)人骨肉瘤的具體作用機(jī)制尚未報(bào)道。PI3K/Akt途徑是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一條重要的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。研究表明，在多種腫瘤組織，如骨肉瘤［10］、胃腸道腫瘤［11］、乳腺癌和前列腺癌［12］等癌組織中均有Akt的過(guò)度表達(dá)及活化，Akt的活化能磷酸化多種下游靶分子，如Bcl-2家族、糖原合成酶激酶3(GSK3)和S6蛋白激酶等，對(duì)細(xì)胞的生存、凋亡和動(dòng)力等有重要影響。Gao等［13］發(fā)現(xiàn)在卵巢癌細(xì)胞中通過(guò)激活PI3K/Akt/mTOR/p70S6K1信號(hào)通路可增加cyclins的表達(dá)，促進(jìn)G1期發(fā)展，促進(jìn)細(xì)胞增殖與分化。Grille等［14］發(fā)現(xiàn)AKT可通過(guò)誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化促進(jìn)鱗狀癌細(xì)胞系的動(dòng)力和侵襲;maseki等［15］發(fā)現(xiàn)Akt/GSK3β/snail信號(hào)通路可介導(dǎo)頭頸鱗狀癌細(xì)胞系的增殖與動(dòng)力;龐瑞萍等［16］發(fā)現(xiàn)吲哚美辛可通過(guò)激活A(yù)kt/GSK3β/NAG-1信號(hào)通路誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞的凋亡。在骨肉瘤治療方面，某些抗腫瘤藥物也可通過(guò)PI3K/Akt信號(hào)途徑抑制骨肉瘤的生長(zhǎng)和發(fā)展，比如松弛素可通過(guò)PI3K/Akt/VEGF通路促進(jìn)Saos-2細(xì)胞的生長(zhǎng)、侵襲以及血管發(fā)生［17］，木黃酮可通過(guò)下調(diào)PI3K/Akt信號(hào)通路從而增強(qiáng)吉西他濱對(duì)骨肉瘤的抗癌效應(yīng)［18］。上述研究提示PI3K/Akt信號(hào)通路的激活對(duì)骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展具有重要的作用。

Figure 5．The effects of LY294002 and wortmannin on rhS100A6-induced migration of 143B cells detected by Transwell assay．Mean ±SD．n=3．*P ＜0.05 vs blank group;#P ＜0.05 vs rhS100A6 group．圖5 LY294002和wortmannin對(duì)rhS100A6誘導(dǎo)的143B細(xì)胞遷移活性的影響

基于上述研究，本研究擬探明S100A6對(duì)骨肉瘤的作用是否經(jīng)由該途徑。結(jié)果表明，rhS100A6在顯著增強(qiáng)人骨肉瘤細(xì)胞143B的增殖和遷移能力的同時(shí)，也能夠上調(diào)Akt的磷酸化，提示PI3K/Akt信號(hào)通路的激活可能參與介導(dǎo)rhS100A6對(duì)143B細(xì)胞的促增殖和遷移作用。隨之，我們應(yīng)用 PI3K抑制劑LY294002或wortmannin來(lái)驗(yàn)證我們的假設(shè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與預(yù)期相符，即LY294002和wortmannin均在明顯逆轉(zhuǎn)rhS100A6誘導(dǎo)的143B細(xì)胞中Akt磷酸化的上調(diào)作用的同時(shí)，也逆轉(zhuǎn)其對(duì)143B細(xì)胞的促細(xì)胞增殖和遷移的作用。所以我們認(rèn)為S100A6對(duì)人骨肉瘤細(xì)胞143B的促增殖與遷移作用至少部分是通過(guò)激活PI3K/Akt信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，本研究在一定程度上揭示了在S100A6介導(dǎo)的促人骨肉瘤細(xì)胞143B增殖及遷移的作用中PI3K/Akt信號(hào)通路的參與，為進(jìn)一步闡明S100A6對(duì)骨肉瘤的作用及機(jī)制、甚至骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也為骨肉瘤的治療研究提供了潛在的靶點(diǎn)。