白慧麗， 李寶林， 何 方， 張汝益， 嚴(yán)樹(shù)涓， 劉 晨， 楊丹丹， 施 瓊

(重慶醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶400016)

肝癌是世界上癌癥死亡的三大原因之一，在我國(guó)居于第二位。肝癌預(yù)后差的主要原因是門靜脈侵襲引起的高發(fā)肝內(nèi)轉(zhuǎn)移［1］，因此，控制肝癌轉(zhuǎn)移是改善病人預(yù)后的重要課題。而早在100多年以前，學(xué)者［2］基于乳腺癌的器官特異性轉(zhuǎn)移中的臨床觀察，提出了著名的“種子與土壤”學(xué)說(shuō)，該學(xué)說(shuō)證實(shí)了腫瘤發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移的整個(gè)過(guò)程都與其所處的微環(huán)境密切相關(guān)。

骨髓基質(zhì)細(xì)胞(marrow stromal cells，MSCs)也被稱為間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)［3］，是腫瘤基質(zhì)的重要組成成分，在體內(nèi)可以通過(guò)分泌多種生長(zhǎng)因子來(lái)影響腫瘤的生長(zhǎng)，其中趨化因子CCL5即受激活調(diào)節(jié)的正常T細(xì)胞表達(dá)和分泌因子(regulated upon activation，normal T-cell expressed and secreted，RANTES)，是 T細(xì)胞和單核細(xì)胞的CC類趨化細(xì)胞因子，其受體有CCR1、CCR3和CCR5。大量研究表明MSCs可以刺激腫瘤細(xì)胞分泌CCL5。Stormes等［4］認(rèn)為高表達(dá) CCL5的腫瘤細(xì)胞具有更強(qiáng)的轉(zhuǎn)移能力。CCL5/CCR5在很多實(shí)體瘤中已有研究，包括乳腺癌、黑色素瘤、胃癌、卵巢癌、子宮頸癌、結(jié)腸癌、前列腺癌和腎癌等［5］。研究發(fā)現(xiàn)CCL5及其受體CCR1和CCR5在肝纖維化的進(jìn)展中發(fā)揮很重要作用［6］。MSCs對(duì)腫瘤的影響可為促進(jìn)作用也可為抑制作用，而對(duì)肝癌細(xì)胞的作用及機(jī)制尚未闡明。因此，本研究采用人骨髓基質(zhì)細(xì)胞HS-5為研究對(duì)象，分別利用HS-5細(xì)胞條件培養(yǎng)基 (HS-5 cell-conditioned medium，HS-5-CM)和HS-5細(xì)胞處理肝癌細(xì)胞SMMC-7721，旨在探討MSCs對(duì)肝癌細(xì)胞的作用和機(jī)制，以及腫瘤微環(huán)境中趨化因子CCL5及其受體分泌的變化，為臨床應(yīng)用提供更廣闊的空間。

材料和方法

1 材料

1．1 細(xì)胞株 人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721和人正常肝細(xì)胞株LO2由重慶醫(yī)科大學(xué)臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室前期保存?zhèn)溆?，人骨髓基質(zhì)細(xì)胞株HS-5購(gòu)自ATCC。

1．2 主要試劑 DMEM高糖培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自HyClone;逆轉(zhuǎn)錄PCR和定量PCR SYBR Premix Ex Taq購(gòu)自TaKaRa;引物由TaKaRa合成;MTT試劑、基質(zhì)膠購(gòu)自Sigma;Human CCL5 ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自RayBio;Western blotting及蛋白質(zhì)提取相關(guān)試劑購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;PI3K特異性抑制劑LY294002、抗Akt抗體和抗p-Akt473抗體購(gòu)自Cell Signaling;抗CCR1、CCR3和CCR5抗體購(gòu)自Abcam;抗β-actin抗體購(gòu)自Santa Cruz;Ⅱ抗山羊抗鼠IgG和山羊抗兔IgG購(gòu)于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)自Millipore;蘇木精、伊紅等試劑為進(jìn)口分裝或國(guó)產(chǎn)分析純。

2 方法

2．1 共培養(yǎng)體系的建立 采用具有PET膜的Transwell小室(孔徑為0.4μm)進(jìn)行間接共培養(yǎng):將HS-5細(xì)胞接種于 Transwell小室 1×105cells/well，SMMC-7721細(xì)胞接種于6孔板2×105cells/well，待細(xì)胞8 h貼壁后，將小室懸掛6孔板上。Control組:SMMC-7721細(xì)胞;co-culture組:SMMC-7721細(xì)胞+HS-5細(xì)胞。2組均更換為雙無(wú)DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)3 d。

2．2 HS-5-CM的制備 將細(xì)胞密度為70%的HS-5細(xì)胞接種于直徑為10 cm的培養(yǎng)皿中，待貼壁后，PBS洗3次，更換為10 mL無(wú)血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，每24 h收集1次上清，并更換為新鮮無(wú)血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，收集3 d，混勻，1 000 r/min離心15 min，取上清配制50%HS-5-CM(HS-5-CM∶無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基為1∶1)和100%HS-5-CM于 －20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2．3 MTT檢測(cè)HS-5-CM對(duì)SMMC-7721細(xì)胞增殖能力的影響 SMMC-7721細(xì)胞以500 cells/well接種于96孔板中，每組6個(gè)平行孔，待細(xì)胞貼壁后PBS洗3次，加入無(wú)血清培養(yǎng)液100μL，control組:SMMC-7721細(xì)胞;50%HS-5-CM組:SMMC-7721細(xì)胞 +50%HS-5-CM;100%HS-5-CM組:SMMC-7721細(xì)胞+100%HS-5-CM。分別于 0 d、1 d、2 d、3 d 對(duì)SMMC-7721細(xì)胞進(jìn)行 MTT檢測(cè)，每孔加入20μL MTT(5．0 g/L)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸盡孔內(nèi)培養(yǎng)液，加入150μL/well DMSO，輕搖振蕩10 min，使紫色結(jié)晶物充分溶解，于酶標(biāo)儀492 nm處檢測(cè)各孔的吸光度(absorbance，A)，重復(fù)3次取平均值。

2．4 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HS-5-CM對(duì)SMMC-7721細(xì)胞遷移能力的影響 SMMC-7721細(xì)胞以2×105cells/well接種于6孔板中，細(xì)胞密度達(dá)到90%時(shí)，用0.5 mm中性筆尖行“一”字劃痕，PBS洗3次，更換為含不同濃度HS-5-CM完全培養(yǎng)基2 mL，倒置顯微鏡下觀察照相，此時(shí)記為0 h;37℃、5%CO2飽和濕度孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)，48 h時(shí)在同一觀察點(diǎn)觀察劃痕愈合情況。實(shí)驗(yàn)分組同上，通過(guò)測(cè)量多個(gè)點(diǎn)劃痕寬度，比較各組的細(xì)胞愈合情況，計(jì)算平均劃痕愈合率。劃痕愈合率(%)=(0 h劃痕寬度－48 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%，重復(fù)3次取平均值。

2．5 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HS-5-CM對(duì)SMMC-7721細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SMMC-7721細(xì)胞制成無(wú)血清的單細(xì)胞懸液，細(xì)胞密度4×107cells/L，取400μL接種在Transwell小室的上室中(做侵襲實(shí)驗(yàn)需要鋪基質(zhì)膠，基質(zhì)膠與預(yù)冷的雙無(wú)

DMEM培養(yǎng)基按1∶7的比例鋪設(shè))，下室中加入600 μL含20%血清的培養(yǎng)液。實(shí)驗(yàn)分組同上，24 h后取出小室，用濕棉簽拭去微孔膜上層細(xì)胞，無(wú)水乙醇固定20 min，蘇木精和伊紅各染色20 min。置于載玻片上在顯微鏡下計(jì)數(shù)，每個(gè)小室至少計(jì)數(shù)10個(gè)視野，每組3個(gè)平行孔，計(jì)算均值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2．6實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR(qRT-PCR)檢測(cè)SMMC-7721細(xì)胞中CCL5及其受體mRNA表達(dá) Trizol法提取各組SMMC-7721細(xì)胞總RNA，按試劑盒的方法逆轉(zhuǎn)錄，以逆轉(zhuǎn)后的cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。通過(guò)Primer Premier 5軟件設(shè)計(jì)引物，引物序列見(jiàn)表1。反應(yīng)體系為:cDNA 2 μL，SyberGreen Mix 10 μL，上、下游引物各0．8 μL，ddH2O 6.4 μL。反應(yīng)條件為:95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60℃ 20 s，72℃ 20 s，共40個(gè)循環(huán)。所有樣本結(jié)果以GAPDH的表達(dá)做相對(duì)定量分析。數(shù)據(jù)分析采用比較Ct法(ΔΔCt)，相對(duì)表達(dá)量 =2－ΔΔCt=2－(ΔCtco-culture－ΔCtcontrol)=2－［(Ct co-culture－Ct GAPDH)－(Ct control－Ct GAPDH)］。實(shí) 驗(yàn) 分 組:control組為SMMC-7721細(xì)胞;co-culture組為SMMC-7721細(xì)胞+HS-5細(xì)胞。

表1 擴(kuò)增基因引物序列Table 1．The sequences of PCR primers for each gene

2．7 ELISA測(cè)定SMMC-7721細(xì)胞培養(yǎng)液中CCL5蛋白表達(dá)水平 收集各組SMMC-7721細(xì)胞培養(yǎng)上清，收集上清24 h前終止共培養(yǎng)并更換為新鮮無(wú)血清培養(yǎng)基，1 000 r/min離心15 min，收集上清液，按照Human CCL5 ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，450 nm處檢測(cè)各孔吸光度值(A)，使用Curve Expert軟件根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各組細(xì)胞中CCL5表達(dá)水平。數(shù)據(jù)取3次重復(fù)的平均值。

2．8 Western blotting測(cè)定 共培養(yǎng) 3 d后，提取SMMC-7721細(xì)胞總蛋白，BCA法檢測(cè)蛋白濃度。取200μg蛋白質(zhì)樣品，與5×上樣緩沖液混合，沸水煮8 min變性，經(jīng) SDS-PAGE、轉(zhuǎn)膜、封閉。加入Ⅰ抗(1∶1 000)，4 ℃ 孵 育 過(guò) 夜，洗 膜，加 入 Ⅱ 抗(1∶5 000)，37 ℃孵育1 h，洗膜，化學(xué)發(fā)光顯影，以 βactin作為內(nèi)參照進(jìn)行吸光度分析，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，采用t檢驗(yàn)比較兩組間差異的顯著性，兩組以上比較采用單因素方差分析。采用SSPS 16．0統(tǒng)計(jì)軟件分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 HS-5-CM能促進(jìn)SMMC-7721細(xì)胞的增殖能力

MTT結(jié)果顯示，細(xì)胞培養(yǎng)第1天、第2天時(shí)50%HS-5-CM和100%HS-5-CM組A492值較control組增加不明顯;第3天時(shí)50%HS-5-CM和100%HS-5-CM組A492值較control組分別增加12.43%(P＞0.05)和43.29%(P＜0.05)，見(jiàn)圖1。這說(shuō)明HS-5-CM可以促進(jìn)SMMC-7721細(xì)胞的增殖能力。

Figure 1．Effects of HS-5-CM on the proliferation of SMMC-7721 cells measured by MTT assay．Mean ± SD．n=3．*P ＜0.05 vs control group．圖1 MTT測(cè)定HS-5-CM對(duì)SMMC-7721細(xì)胞增殖的影響

2 HS-5-CM能促進(jìn)SMMC-7721細(xì)胞的遷移能力

劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，50%HS-5-CM組和100%HS-5-CM組的細(xì)胞劃痕在48 h愈合率分別是65.35% ±2.46%和88.99% ±2.59%，與control組(52.73% ±2.53%)比較差異顯著 (P＜0.01)，見(jiàn)圖2A。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，control組中 SMMC-7721細(xì)胞穿過(guò)小室膜的細(xì)胞數(shù)為(32±3)個(gè)，50%HS-5-CM組和100%HS-5-CM組則分別為(80±4)個(gè)和(124±4)個(gè)，均較control明顯增加(P＜0.01)，見(jiàn)圖2B。這說(shuō)明HS-5-CM明顯促進(jìn)SMMC-7721細(xì)胞的遷移。

Figure 2．Effects of HS-5-CM on the migration of SMMC-7721 cells．A:the migration of SMMC-7721 cells measured by wound-healing assay(×100);B:the migration of SMMC-7721 cells measured by Transwell assay(×150)．Mean±SD．n=3．＊＊P ＜0.01 vs control group．圖2 HS-5-CM對(duì)SMMC-7721細(xì)胞遷移的影響

3 HS-5-CM能促進(jìn)SMMC-7721細(xì)胞的侵襲能力

Control組中穿過(guò)基質(zhì)膠的細(xì)胞數(shù)為(45±5)個(gè)，50%HS-5-CM組和100%HS-5-CM組則分別為(87±3)個(gè)和(110±7)個(gè)，100%HS-5-CM組較control組明顯增加(P＜0.01)，見(jiàn)圖3。這提示 HS-5-CM明顯促進(jìn)SMMC-7721細(xì)胞的侵襲。

4 HS-5細(xì)胞可以增加SMMC-7721細(xì)胞中CCL5的表達(dá)

qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示(圖4A)，共培養(yǎng)3 d，與control組比，co-culture組 SMMC-7721細(xì)胞中 CCL5 mRNA表達(dá)增加69．39%(P＜0.05);同樣，ELISA方法檢測(cè)SMMC-7721細(xì)胞上清中CCL5蛋白表達(dá)(圖4B)，第 1天時(shí) co-culture組較 control組增加4.22%，第2天增加7.84%，第3天增加57.13%(P＜0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這表明HS-5細(xì)胞可以增加SMMC-7721細(xì)胞中CCL5的表達(dá)。

Figure 3．Effects of HS-5-CM on the invasion of SMMC-7721 cells measured by Transwell assay(×150)．Mean±SD．n=3．＊＊P ＜0.01 vs control group．圖3 Transwell實(shí)驗(yàn)測(cè)定HS-5-CM對(duì)SMMC-7721細(xì)胞侵襲的影響

Figure 4．The expression of CCL5 mRNA and protein in SMMC-7721 cells after co-cultured with HS-5 cells．A:CCL5 mRNA detected by qRT-PCR;B:CCL5 protein detected by ELISA assay．Mean ± SD．n=3．*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control group．圖4 SMMC-7721細(xì)胞與HS-5細(xì)胞共培養(yǎng)后SMMC-7721細(xì)胞中的CCL5 mRNA和蛋白的表達(dá)變化

5 HS-5細(xì)胞可以增加SMMC-7721細(xì)胞中CCL5受體CCR5的表達(dá)

qRT-PCR及Western blotting結(jié)果顯示，共培養(yǎng)3 d，co-culture組與control組相比，CCR1和CCR3 mRNA和蛋白表達(dá)變化不大，而CCR5 mRNA表達(dá)較control組明顯上升49．95%(P＜0.01)，蛋白水平較control組增加了1．77倍(P＜0.01)，見(jiàn)圖5。這說(shuō)明HS-5細(xì)胞能增加SMMC-7721細(xì)胞中CCR5 mRNA和蛋白表達(dá)。

Figure 5．The expression of CCR1，CCR3 and CCR5 mRNA and proteins in SMMC-7721 cells after co-cultured with HS-5 cells for 3 d．A:CCR1，CCR3 and CCR5 mRNA detected by qRT-PCR;B:CCR1，CCR3 and CCR5 proteins detected by Western blotting．Mean±SD．n=3．＊＊P ＜0.01 vs control group．圖5 SMMC-7721細(xì)胞與HS-5細(xì)胞共培養(yǎng)3 d后SMMC-7721細(xì)胞中CCR1、CCR3和CCR5 mRNA和蛋白表達(dá)變化

6 激活PI3K-Akt通路可以增加共培養(yǎng)后SMMC-7721細(xì)胞中CCL5的表達(dá)

Western blotting結(jié)果顯示(圖6A)，與control組相比，co-culture組的SMMC-7721細(xì)胞總Akt蛋白水平增加 98.68%(P＜0.01)，p-Akt473增加26.78%(P＜0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。加入20μmol/L PI3K抑制劑 LY294002處理24 h后，co-culture組SMMC-7721細(xì)胞的總Akt和p-Akt473蛋白表達(dá)分別減少77.21%(P＜0.01)和61.59%(P＜0.01);control組 SMMC-7721細(xì)胞的 p-Akt473水平減少31.35%(P＜0.05)，但總Akt的蛋白水平變化不明顯。qRT-PCR(圖6B)和ELISA檢測(cè)(圖6C)顯示，LY294002減少了co-culture組 SMMC-7721細(xì)胞中CCL5 mRNA(P＜0.01)和蛋白表達(dá)(P＜0.05)，但是LY294002對(duì)control組CCL5分泌影響不大。

討 論

MSCs作為一種新型的基因治療的靶細(xì)胞，已廣泛應(yīng)用于解決肝移植、肝細(xì)胞移植和人工肝等治療肝源短缺的問(wèn)題。目前MSCs作為組織工程最有希望的種子細(xì)胞，具有多向分化潛能及低免疫源性等特點(diǎn)，而且諸多實(shí)驗(yàn)研究表明MSCs在體內(nèi)外均能被誘導(dǎo)分化為肝細(xì)胞［7］。本課題應(yīng)用的HS-5細(xì)胞為永生化的人MSCs，解決了原代細(xì)胞不易提取、傳代次數(shù)少的問(wèn)題。大多文獻(xiàn)報(bào)道MSCs存在雙向性，在白血?。?］、非霍奇金淋巴瘤［9］研究中 MSCs抑制腫瘤的增殖和發(fā)展，而在乳腺癌［10］、前列腺癌［11］研究中發(fā)現(xiàn)MSCs促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。本實(shí)驗(yàn)中采用HS-5-CM處理SMMC-7721細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)HS-5-CM可以促進(jìn)SMMC-7721細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的能力，并采用間接共培養(yǎng)的方法，人為構(gòu)建腫瘤微環(huán)境使得MSCs向腫瘤細(xì)胞趨化，來(lái)驗(yàn)證HS-5細(xì)胞對(duì)肝癌細(xì)胞SMMC-7721的作用，得出與HS-5-CM相似的結(jié)果。這可能為MSCs主要通過(guò)旁分泌細(xì)胞因子來(lái)誘導(dǎo)肝癌微環(huán)境的變化提供可能性依據(jù)。

有文獻(xiàn)報(bào)道MSCs的分布大多聚集在腫瘤部位［12］，可能是因?yàn)槟[瘤細(xì)胞可以分泌趨化因子、細(xì)胞因子來(lái)招募和激活大量的未分化的基質(zhì)細(xì)胞，反過(guò)來(lái)，基質(zhì)細(xì)胞也促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移［13］。越來(lái)越多的研究表明，趨化因子及其受體在腫瘤的發(fā)生發(fā)展，尤其是腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程中具有重要作用［14］。Aldinucci等［15］證實(shí)CCL5/CCR5信號(hào)通路不僅能參與調(diào)控霍奇金淋巴瘤細(xì)胞的增殖，而且在維持霍奇金淋巴瘤的組織微環(huán)境中也發(fā)揮重要作用。本研究中SMMC-7721細(xì)胞的CCL5表達(dá)水平較低，共培養(yǎng)后，CCL5 mRNA和蛋白水平均有明顯增加，其受體CCR5也明顯增加。因此我們認(rèn)為在構(gòu)建的腫瘤微環(huán)境體外模型中，CCL5有可能是通過(guò)CCR5起作用的。CCL5被稱為是一個(gè)存在于腫瘤細(xì)胞和基質(zhì)之間的中介者，而且CCL5也可以增加肝炎病人肝癌的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)［16］。此研究中 ELISA測(cè)定培養(yǎng)上清中CCL5的表達(dá)增加，測(cè)定的培養(yǎng)基為終止共培養(yǎng)后的新鮮培養(yǎng)基，可以認(rèn)為是HS-5細(xì)胞介導(dǎo)的微環(huán)境刺激了SMMC-7721細(xì)胞自身的CCL5分泌增加，那么HS-5細(xì)胞促進(jìn)肝癌細(xì)胞SMMC-7721的侵襲和遷移能力是否與此有關(guān)還有待我們深一步的探討。此外Western blotting顯示，PI3K抑制劑可以抑制共培養(yǎng)后SMMC-7721細(xì)胞PI3K-Akt通路的Akt和p-Akt的升高。文獻(xiàn)指出 CCL5 可以激活 Gαi-PI3K-Akt［17］，本課題的進(jìn)一步研究得出PI3K抑制劑下調(diào)了共培養(yǎng)后SMMC-7721細(xì)胞CCL5的表達(dá)，這說(shuō)明CCL5的升高在肝癌微環(huán)境中是通過(guò)PI3K-Akt通路發(fā)揮作用的。

綜上所述，本研究說(shuō)明了HS-5細(xì)胞可以促進(jìn)肝癌細(xì)胞SMMC-7721的增殖、遷移和侵襲能力，而且可以通過(guò)激活PI3K-Akt通路增加SMMC-7721細(xì)胞CCL5的分泌，幫助我們進(jìn)一步研究趨化因子在腫瘤微環(huán)境中的作用提供方向，并為人工肝移植提供理論依據(jù)。

Figure 6．Expression of Akt，p-Akt473 and CCL5 in SMMC-7721 cells treated with PI3K inhibitor LY294002 after co-cultured with HS-5 cells．A:expression of Akt and p-Akt473 proteins detected by Western blotting;B:expression of CCL5 mRNA detected by qRT-PCR;C:secretion of CCL5 protein detected by ELISA assay．Mean±SD．n=3．#P＜0.05，##P＜0.01 vs control group;*P ＜0.05，＊＊ P ＜0.01 vs co-culture group．圖6 PI3K抑制劑LY294002對(duì)共培養(yǎng)后SMMC-7721的Akt、p-Akt473和CCL5表達(dá)的影響