陳小珍，陳萬(wàn)勤，王 瑾，黃麗英，張東雷

（浙江省質(zhì)量檢測(cè)科學(xué)研究院，浙江省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310013）

雙氰胺（dicyandiamide，DCD）又稱二氰二胺，分子式為C2N4H4。雙氰胺是一種白色結(jié)晶粉末，可溶于水，是一種重要的有機(jī)化工原料，可用于生產(chǎn)三聚氰胺［1］，在醫(yī)藥工業(yè)中也可以用于制取硝酸胍和磺胺類藥物，還可以用于固色劑、黏合劑等［2，3］，農(nóng)業(yè)上用于對(duì)肥料的凝固作用，防止肥料流失，對(duì)肥料中的硝酸鹽類（如硝酸鉀）、胺類化合物進(jìn)行中和，減少該類化學(xué)物質(zhì)的有害作用［4］。雙氰胺對(duì)人體是否有害以及含量多少會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生危害目前尚沒有明確的研究結(jié)論，還需要進(jìn)行毒理研究。但雙氰胺是含氮量高且性質(zhì)較穩(wěn)定的非蛋白氮物質(zhì)，少量加入不影響食品風(fēng)味；由于目前國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的蛋白質(zhì)測(cè)定方法基于凱氏定氮法，樣品中任何含氮物質(zhì)均折算成蛋白質(zhì)含量，因此很可能被不法商家利用，非法添加到食品中。最近在新西蘭奶粉中發(fā)現(xiàn)含有雙氰胺，引起國(guó)際社會(huì)的廣泛關(guān)注。

當(dāng)前雙氰胺的檢測(cè)方法有高效液相色譜-質(zhì)譜法［5-7］和高效液相色譜法［8-10］，這些方法大多數(shù)是關(guān)于生物醫(yī)藥樣品中雙氰胺的檢測(cè)，雙氰胺的色譜保留時(shí)間大多數(shù)都在3.0min以內(nèi)，適合于基質(zhì)干凈的生物醫(yī)藥產(chǎn)品；關(guān)于基質(zhì)較復(fù)雜的乳制品中雙氰胺的檢測(cè)方法僅有少數(shù)報(bào)道［11，12］，均為液相色譜-質(zhì)譜法。由于雙氰胺在常規(guī)色譜分離中保留時(shí)間短，雜質(zhì)干擾嚴(yán)重，難以準(zhǔn)確進(jìn)行定性和定量分析，到目前為止關(guān)于乳制品中雙氰胺的液相色譜-紫外檢測(cè)法未見報(bào)道。本文建立了乳制品中雙氰胺的高效液相色譜-紫外檢測(cè)法，優(yōu)化了前處理方法和高效液相色譜條件。該方法簡(jiǎn)便、快速、有效，適用于乳制品中雙氰胺的檢測(cè)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、設(shè)備和試劑

Agilent 1260高效液相色譜儀（配二極管陣列檢測(cè)器）；乙腈、甲酸（色譜純，Merck公司）；試驗(yàn)用水為 Milli-Q超純水。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì):雙氰胺（純度99.4%，Sigma-Aldrich公司）。

雙氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制:準(zhǔn)確稱取100mg雙氰胺標(biāo)準(zhǔn)品于100mL容量瓶中，用水溶解，配制成1.0g／L的儲(chǔ)備液。用流動(dòng)相將標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液稀釋成0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0mg／L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2 色譜條件

液相色譜柱:XBridge Amide柱（250mm×4.6 mm，3.5μm，Waters公司）；柱溫:35℃；進(jìn)樣量:20μL；流動(dòng)相:乙腈-水（體積比為90∶10）（含體積分?jǐn)?shù)為0.2%的甲酸）；流速:1.0mL／min；檢測(cè)波長(zhǎng):218nm。

1.3 樣品前處理

稱取固態(tài)、半固態(tài)樣品（奶粉、煉乳等）1g（精確到0.01g）或液態(tài)樣品（純奶、酸奶等）2g（精確到0.01g），置于10.0mL比色管中，固態(tài)、半固態(tài)樣品加入3mL 70℃熱水，液態(tài)樣品加入1mL 70℃熱水充分渦旋2min，置于70℃熱水浴中15min充分溶解提取，冷卻至室溫，渦旋中分3次加入乙腈，每次加入2mL，最后用乙腈定容至10.0mL，渦旋搖勻，取2mL液體至2mL離心管中，以8000r／min離心10min，取1.0mL上清液于50℃下氮?dú)獯蹈桑?.0mL流動(dòng)相溶解，過0.45μm濾膜，濾液供HPLC分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

對(duì)雙氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行光譜掃描，發(fā)現(xiàn)在218 nm處有最大吸收，確定其檢測(cè)波長(zhǎng)為218nm。

雙氰胺在C18柱上幾乎無(wú)保留。雙氰胺的性質(zhì)和三聚氰胺類似，因此試圖采用與三聚氰胺檢測(cè)相同的多種離子對(duì)試劑如庚烷磺酸鈉等作為流動(dòng)相［13，14］，但是沒有達(dá)到預(yù)期效果?；陔p氰胺的性質(zhì)，采用了XBridge Amide柱作為分離柱。選擇不同比例的乙腈-水作為流動(dòng)相，對(duì)雙氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定，沒有出現(xiàn)目標(biāo)物色譜峰，加入少量甲酸后，得到相應(yīng)的目標(biāo)物色譜峰。通過實(shí)驗(yàn)最終確定以含0.2%甲酸的乙腈-水（90／10，v／v）作為流動(dòng)相時(shí)，目標(biāo)峰的峰形和保留時(shí)間最佳，并且目標(biāo)峰的保留時(shí)間為5min左右，大大減少了基質(zhì)對(duì)目標(biāo)峰的干擾作用，優(yōu)化條件下的標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖見圖1。

圖1 雙氰胺的高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of dicyandiamide a.standard；b.spiked milk sample.

2.2 前處理方法的建立

乳制品基質(zhì)比較復(fù)雜，對(duì)檢測(cè)的主要干擾物為脂肪和蛋白質(zhì)，因此除去脂肪和蛋白質(zhì)的干擾最為關(guān)鍵。綜合考慮采用有機(jī)試劑沉淀蛋白質(zhì)，便于后續(xù)樣品的處理。

直接用乙腈進(jìn)行定容后渦旋超聲提取，發(fā)現(xiàn)回收效果不穩(wěn)定，回收率差異較大，且乳制品中的蛋白質(zhì)往往黏結(jié)成塊狀。推測(cè)在乙腈快速加入后，蛋白質(zhì)迅速黏結(jié)包夾了部分雙氰胺?？疾炝司徛尤胍译鎸?duì)蛋白質(zhì)沉淀和回收率的影響。結(jié)果表明，在渦旋條件下，緩慢加入乙腈能有效地防止蛋白質(zhì)迅速黏結(jié)，蛋白質(zhì)呈分散狀態(tài)，回收率高且穩(wěn)定。另外還考察了超聲提取對(duì)回收率的影響，結(jié)果表明，在渦旋過程中緩慢加入乙腈后超聲與否不影響提取效果。故本文采用在渦旋過程中緩慢加入乙腈的提取方式。

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)將上述提取液過微孔濾膜后直接進(jìn)樣，樣品色譜圖會(huì)有很高的溶劑峰。取1.0mL提取液于50℃下氮?dú)獯蹈?，再?.0mL流動(dòng)相溶解，過濾膜，濾液供HPLC分析，則樣品色譜圖中的溶劑峰消失，因此，樣品提取后取1.0mL提取液用氮?dú)獯蹈?，再用流?dòng)相重新溶解樣品，供色譜檢測(cè)。

2.3 線性范圍、檢出限和定量限

對(duì)雙氰胺的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行檢測(cè)，以儀器響應(yīng)的峰面積Y對(duì)雙氰胺的質(zhì)量濃度X進(jìn)行線性回歸，雙氰胺在0.5～50mg／L范圍內(nèi)的線性關(guān)系良好，回歸方程為Y＝153.87 X＋21.56，相關(guān)系數(shù)（r2）為0.9999。在空白樣品處理液中添加雙氰胺標(biāo)準(zhǔn)品，以S／N＝3確定方法的檢出限，以S／N＝10確定方法的定量限，得到雙氰胺的檢出限為0.2mg／kg，定量限為0.5mg／kg。

2.4 回收率和精密度

對(duì)乳粉（經(jīng)確認(rèn)不含雙氰胺）樣品進(jìn)行回收率試驗(yàn)，添加水平分別為1.0、2.0和5.0mg／kg，采用優(yōu)化后的前處理方法對(duì)樣品進(jìn)行處理，每個(gè)添加水平重復(fù)6次，平均回收率分別為101.0%、96.7%和99.7%，RSD分別為4.8%、4.5%和4.9%（見表1）。

表1 乳制品中雙氰胺的加標(biāo)回收率（n＝6）Table 1 Recovery of dicyandiamide spiked in dairy products（n＝6）

2.5 實(shí)際樣品測(cè)定

采用本方法對(duì)鮮奶、酸奶、煉乳、乳粉等40批乳制品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果均未檢出雙氰胺。

3 結(jié)論

利用高效液相色譜法對(duì)乳制品中的雙氰胺進(jìn)行分析，該方法優(yōu)化了XBridge Amide柱的分析條件，色譜峰保留時(shí)間優(yōu)化為5min左右，大大降低了基質(zhì)的干擾，方法簡(jiǎn)單快速，準(zhǔn)確度和精密度高，適用于各種乳制品中雙氰胺的檢測(cè)。采用乙腈作為沉淀劑能有效地沉淀蛋白質(zhì)，消除蛋白質(zhì)干擾，從而保障了該方法對(duì)乳制品中雙氰胺分析的準(zhǔn)確性。本方法適用于乳制品中雙氰胺的分析和質(zhì)量控制。

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