陳 靜，劉召金，戴振宇，安保超，許 群＊，張祥民

（1.復(fù)旦大學(xué)化學(xué)系，上海 200433；2.賽默飛世爾科技中國(guó)有限公司，上海 201203；3.山東省鄒城市食品質(zhì)量檢驗(yàn)中心，山東 鄒城 273500）

質(zhì)譜（MS）和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS）技術(shù)已經(jīng)成為分析復(fù)雜生化樣品的有效手段。但生化樣品如多肽和蛋白質(zhì)的制備過(guò)程中所大量使用的高濃度鹽會(huì)干擾質(zhì)譜分析的離子化過(guò)程，從而導(dǎo)致分析物峰強(qiáng)度降低和離子源污染，致使檢測(cè)無(wú)法進(jìn)行。因此，質(zhì)譜檢測(cè)前對(duì)樣品的除鹽顯得尤為重要。目前常用的除鹽方法主要是固相萃取技術(shù)（SPE），即蛋白質(zhì)或多肽保留在吸附材料上，鹽類不吸附而被除去，然后將保留的蛋白質(zhì)或多肽洗脫下來(lái)進(jìn)行檢測(cè)。常用的吸附材料有反相固定相、高分子聚合物、石墨化碳、納米材料等。將這些材料填充或者整體聚合在小柱或微柱中，用于蛋白質(zhì)或多肽的除鹽與富集［1］。常見(jiàn)的 SPE 有離線（off-line）和在線（online）技術(shù)。與前者相比，后者具有自動(dòng)化程度高、節(jié)約時(shí)間和方法重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)，其相關(guān)技術(shù)的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用日益受到重視［2-6］。

本文建立了一種簡(jiǎn)單、快速和有效的在線固相萃取方法，可用于質(zhì)譜和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析生化樣品的高通量除鹽。方法分為單柱和雙柱兩種模式，借助于包含雙梯度泵、自動(dòng)進(jìn)樣器和配有2位十通切換閥的柱溫箱的高效液相色譜（HPLC）系統(tǒng)，在色譜管理軟件的控制下，完成樣品的在線除鹽，實(shí)現(xiàn)了除鹽自動(dòng)化。以磷酸緩沖鹽質(zhì)量濃度為1.0 g／L的寡核苷酸樣品為例，在雙萃取柱模式下的除鹽、淋洗以及分離測(cè)定在1.1min即可完成，大大提高了工作效率。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Thermo UltiMate 3000高效液相色譜儀，帶有雙三元梯度泵（DGP-3600A），配置六通道在線脫氣機(jī)（SRD-3600）、自動(dòng)進(jìn)樣器（WPS-3000TSL，帶大體積進(jìn)樣組件）、柱溫箱（TCC-3200RS，帶2位十通切換閥）、二極管陣列檢測(cè)器（DAD-3400RS）；變色龍色譜管理軟件（Chromeleon?6.8SR9），美國(guó)賽默飛世爾公司。

乙腈（色譜純），去離子水（18.2MΩ·cm），碳酸氫銨、甲酸、溴化鉀均為分析純。

1.2 樣品

含高濃度磷酸緩沖鹽的寡核苷酸樣品由江蘇某生化制品公司提供；經(jīng)過(guò)純化和除鹽的牛血清蛋白（BSA）標(biāo)準(zhǔn)品由上海阿敏生物技術(shù)有限公司提供。

1.3 在線固相萃取除鹽單萃取柱模式的流程

以對(duì)含有4g／L KBr的BSA標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行除鹽為例，描述本研究中在線串聯(lián)固相萃取除鹽單萃取柱模式的流程（見(jiàn)圖1）。十通閥1-10位通時(shí)，上樣泵以0.1%（如無(wú)特殊說(shuō)明均為體積分?jǐn)?shù)）HCOOH溶液為流動(dòng)相，1.5mL／min流速進(jìn)樣。樣品溶液中的BSA被保留在SPE柱（Acclaim PA II Guard，10mm×4.3mm，5μm）上，而KBr不保留，被淋洗出SPE柱。在SPE柱上完成除鹽后，通過(guò)閥切換使1-2位通，分析泵以0.1%HCOOH溶液-乙腈（6∶4，v／v）為流動(dòng)相，1mL／min流速淋洗SPE柱，將富集的BSA洗脫。通過(guò)流路①與MS直接連接進(jìn)行分析（on-line SPE-MS），或與紫外（UV）檢測(cè)器連接直接進(jìn)行在線固相萃取-流動(dòng)注射（on-line SPE-flow injection）分析；或通過(guò)流路②經(jīng)過(guò)色譜柱（Acclaim PAⅡ，33mm×3.0mm，3 μm）分離后進(jìn)入 MS進(jìn)行分析（on-line SPE-LCMS），或使用紫外檢測(cè)器進(jìn)行分析（on-line SPEHPLC）。

圖1 在線固相萃取除鹽單萃取柱模式的流程圖Fig.1 Schematic diagram of the on-line SPE desalting system of single SPE column mode

1.4 在線固相萃取除鹽雙萃取柱模式的流程

同樣，以對(duì)含有4g／L KBr的BSA標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行除鹽為例，描述本研究中的在線固相萃取除鹽雙萃取柱模式的流程（見(jiàn)圖2）。上樣泵和分析泵所用的流動(dòng)相、色譜柱以及萃取和淋洗條件均與單柱模式相同。十通閥1-2位通時(shí)，在SPE柱1上進(jìn)樣和除鹽（周期1）。上樣泵進(jìn)樣后，樣品溶液中的BSA被保留在SPE柱1上，而KBr不保留，被淋洗出SPE柱。當(dāng)周期1完成，將十通閥切換至1-10位通，周期2（在SPE柱2上進(jìn)樣和除鹽）開(kāi)始，其使用的SPE柱和條件均與周期1相同。與此同時(shí)，分析泵將富集的BSA洗脫，通過(guò)流路①與MS或與紫外檢測(cè)器直接連接進(jìn)行分析；或通過(guò)流路②經(jīng)過(guò)色譜柱（Acclaim 300C18，50mm×4.6mm，3μm）分離后進(jìn)入MS或紫外檢測(cè)器進(jìn)行分析。當(dāng)周期2完成，將十通閥切換回至1-2位通，周期1又開(kāi)始運(yùn)轉(zhuǎn)；同時(shí)，富集在SPE柱2上的BSA則被洗脫、檢測(cè)或經(jīng)過(guò)分離后檢測(cè)。這樣，SPE柱1和2輪流工作，高效率地完成樣品的在線除鹽及檢測(cè)。

圖2 在線固相萃取除鹽雙萃取柱模式的流程圖Fig.2 Schematic diagram of the on-line SPE desalting system of dual SPE column mode

2 結(jié)果與討論

2.1 除鹽效果的評(píng)價(jià)

提高在線固相萃取除鹽效果的方法一般有兩種，一是延長(zhǎng)除鹽時(shí)間，也就是延長(zhǎng)切閥時(shí)間；二是增大除鹽的流速。由于生化樣品制備時(shí)通常所使用的緩沖鹽溶液如磷酸鹽溶液沒(méi)有紫外吸收，在方法開(kāi)發(fā)時(shí)可以通過(guò)向樣品溶液中加入有紫外吸收的鹽如KBr來(lái)判斷除鹽效果。

圖3是單萃取柱模式下，不同質(zhì)量濃度KBr溶液進(jìn)行在線固相萃取-流動(dòng)注射分析的色譜圖?？梢杂^察到，0.5min時(shí)2.0和4.0g／L的 KBr溶液尚有殘余，但1.5min時(shí)4.0g／L的KBr溶液也已經(jīng)完全除去，表明延長(zhǎng)固相萃取除鹽時(shí)間，在線固相萃取除鹽效果得到提高。

圖3 在線固相萃取除鹽單萃取柱模式下不同質(zhì)量濃度KBr溶液的流動(dòng)注射分析色譜圖Fig.3 Chromatograms of on-line SPE-flow injection analysis of KBr solutions with different mass concentrations using the on-line SPE desalting single SPE column mode

圖4 在線固相萃取除鹽單萃取柱模式下的含有2.0 g／L KBr的寡核苷酸樣品在除鹽流速為（a）1.0 mL／min和（b）2.0 mL／min時(shí)的高效液相色譜圖Fig.4 Chromatograms of on-line SPE-HPLC analysis of an oligonucleotide sample spiked with 2.0 g／L KBr and desalted at the flow rates of（a）1.0 mL／min and（b）2.0 mL／min using the on-line SPE desalting single SPE column mode

圖4是單萃取柱模式下不同除鹽流速時(shí)，含有2.0g／L KBr的寡核苷酸樣品的在線固相萃取-高效液相色譜圖。如圖4a所示，除鹽流速為1.0 mL／min時(shí)寡核苷酸色譜峰后有一個(gè)小色譜峰。經(jīng)過(guò)紫外吸收光譜比對(duì)可確認(rèn)該峰是殘留的KBr，說(shuō)明樣品中的鹽沒(méi)有完全去除。而如圖4b所示，當(dāng)除鹽流速增大至2.0mL／min時(shí)該色譜峰消失，表明樣品中的鹽已經(jīng)去除。因此，通過(guò)增大固相萃取除鹽的流速，可以提高在線固相萃取除鹽效果。

2.2 在線固相萃取除鹽方法的重現(xiàn)性

通過(guò)計(jì)算雙萃取柱模式下連續(xù)進(jìn)樣10次含有4.0g／L KBr的BSA溶液（每個(gè)萃取柱上各5次），所得到的BSA色譜峰（見(jiàn)圖5）的保留時(shí)間和峰面積的RSD來(lái)評(píng)估在線固相萃取除鹽方法的重現(xiàn)性。BSA保留時(shí)間的RSD為0.1%，峰面積的RSD為1.0%，說(shuō)明該方法的重現(xiàn)性良好。

圖5 在線固相萃取除鹽雙萃取柱模式下連續(xù)進(jìn)樣10次含有4.0 g／L KBr的BSA溶液（每個(gè)萃取柱上各5次）的高效液相色譜圖Fig.5 Chromatograms of 10 consecutive injections（5 injections for each SPE column）on on-line SPE-HPLC of BSA spiked with 4.0 g／L KBr using the on-line SPE desalting dual SPE column mode

當(dāng)樣品溶液中的鹽濃度不高時(shí)，采取雙萃取柱模式，通過(guò)適當(dāng)縮短閥切換時(shí)間可以大大提高在線固相萃取除鹽的效率；但頻繁的閥切換可能會(huì)導(dǎo)致方法重現(xiàn)性的降低。因此，機(jī)械性能良好的雙梯度泵是實(shí)現(xiàn)這一目的的保證。圖6是磷酸緩沖鹽質(zhì)量濃度低于1.0g／L的寡核苷酸樣品在雙萃取柱模式下的液相色譜圖，閥切換時(shí)間縮短至0.4min，連續(xù)進(jìn)樣8次（每個(gè)萃取柱上各4次）。除鹽、淋洗和分離測(cè)定在1.1min即可完成。寡核苷酸保留時(shí)間的RSD為0，峰面積的RSD為1.5%。

圖6 在線固相萃取除鹽雙萃取柱模式下連續(xù)進(jìn)樣8次寡核苷酸樣品（每個(gè)萃取柱上各4次）的高效液相色譜圖Fig.6 Chromatograms of 8 consecutive injections（4injections for each SPE column）on on-line SPEHPLC of the oligonucleotide sample using the online SPE desalting dual SPE column mode

3 結(jié)語(yǔ)

本文建立了簡(jiǎn)單、快速和有效的適用于與質(zhì)譜和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的生化樣品在線高通量固相萃取除鹽方法。方法分為單柱和雙柱兩種模式，樣品除鹽過(guò)程完全由液相色譜系統(tǒng)自動(dòng)完成。與傳統(tǒng)除鹽方法相比，該方法具有樣品需求量小、試劑消耗量少、操作簡(jiǎn)單、分析成本低廉、除鹽效率高等特點(diǎn)，大大提高了工作效率。因此，該技術(shù)在生化樣品的分析中有很好的應(yīng)用前景。

［1］Cook K，Thayer J.Bioanalysis，2011，3（10）:1109

［2］Sun L L，Duan J C，Tao D Y，et al.Rapid Commun Mass Spectrom，2008，22（15）:2391

［3］Fountain K J，Gilar M，Gebler J C.Rapid Commun Mass Spectrom，2004，18（12）:1295

［4］Yoshida H，Mizukoshi T，Hirayama K，et al.J Chromatogr A，2006，1119（1／2）:315

［5］Thayer J R，Puri N，Burnett C，et al.Anal Biochem，2010，399（1）:110

［6］Liu J，Pan Y H，Xu Q，et al.Scientia Agricultura Sinica（劉靜，潘映紅，徐琴，等.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)），2009，42（3）:772