李 雪，牟光慶，陳歷?。?，姜鐵民

（1.大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 大連 116034；2.北京三元食品股份有限公司，北京 100076）

環(huán)境雌激素是指由于人類的生產(chǎn)、生活而釋放到環(huán)境中，進(jìn)入生物體內(nèi)后起到類似雌激素的作用，從而擾亂生物體正常內(nèi)分泌功能的一類人工合成化學(xué)物 質(zhì)［1，2］。另外，一些天然雌激素（如雌三醇（E3）、雌二醇（E2）、雌酮（E1）等）也能產(chǎn)生上述環(huán)境雌激素污染［3］。由于環(huán)境雌激素具有毒性作用劑量少、潛伏期長(zhǎng)、易富集的特點(diǎn)，必須提高對(duì)環(huán)境雌激素污染問題的認(rèn)識(shí)和研究。

在各種食品污染問題中，雌激素殘留問題最容易被忽視，而在近幾年，奶制品中雌激素殘留的問題日益嚴(yán)重，因此必須從奶源根部抓起，追溯到奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)的微環(huán)境，從根源發(fā)現(xiàn)和解決問題，完成環(huán)境雌激素的檢測(cè)。在人們的關(guān)注中，除了要監(jiān)控奶制品加工過程中的雌激素添加外，還應(yīng)把眼光投放在牛場(chǎng)微環(huán)境中殘存的環(huán)境雌激素，因?yàn)榕Ｄ讨械沫h(huán)境雌激素主要是外源性性激素，通過飼養(yǎng)奶牛所用的飲用水、臥床土、動(dòng)物飼料及催熟植物所用的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑等而引入［4］。

目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于環(huán)境雌激素多殘留檢測(cè)的方法主要有氣相色譜-質(zhì)譜法和液相色譜-質(zhì)譜法［5-16］。這些方法測(cè)定的樣品以奶制品［5-8］和水樣［9-11］為主，另 外 還 有 水產(chǎn) 品［12］、化 妝 品［13］、肉 制 品［14］、污泥［15，16］、尿液［17］等。而關(guān)于飼料和臥床土中環(huán)境雌激素的研究報(bào)道很少，特別是本文研究的雌三醇、雌二醇、雌酮、雙酚A（BPA）和己烯雌酚（DES）這5種環(huán)境雌激素同時(shí)檢測(cè)的分析方法更是少之又少。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)取自于北京地區(qū)不同奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)的飼料和臥床土樣品環(huán)境雌激素多殘留測(cè)定，建立了飼料和臥床土中環(huán)境雌激素多殘留測(cè)定的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，并對(duì)色譜條件、質(zhì)譜條件及樣品前處理方法等進(jìn)行了優(yōu)化，取得了較為滿意的結(jié)果；完成了對(duì)奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)微環(huán)境中的飼料和臥床土的環(huán)境雌激素的追蹤與檢測(cè)，為追溯原料奶中環(huán)境雌激素的來源提供了參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑與材料

ACQUITY UPLC超高效液相色譜儀（美國(guó)Waters公司）；API4000串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀（美國(guó)Waters公司），配有MassLynx數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)；KQ-500DE醫(yī)用數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Sigma 2K-15高速冷凍離心機(jī)（北京博勱行儀器有限公司）；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海振捷實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；SHB-Ⅲ型水循環(huán)真空泵（鄭州市上街區(qū)儀器廠）。

5種環(huán)境雌激素標(biāo)準(zhǔn)品:雌三醇、雌二醇（中國(guó)食品藥品檢定研究所），雌酮、雙酚 A（德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司），己烯雌酚（中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院），純度≥96.70%。NH2固相萃取柱（500mg／3 mL，美國(guó)Agela公司）。甲醇、乙腈（色譜純，美國(guó)Fisher公司）。氨水、甲苯、無水硫酸鈉（分析純）。超純水（美國(guó)Milli-Q超純水儀制備）。氮?dú)狻鍤猓兌龋?9.99%）。微孔濾膜（孔徑0.22μm）。飼料、臥床土（北京市11個(gè)奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)）。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

準(zhǔn)確稱取E3、E2、E1、BPA以及DES標(biāo)準(zhǔn)品10.00mg，分別置于10mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，超聲振蕩均勻后得到E3、E2、E1、BPA及DES（質(zhì)量濃度均為1.00g／L）的單一標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，于-20℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩Ｆ渌煌瑵舛鹊母鳂?biāo)準(zhǔn)溶液由儲(chǔ)備液稀釋得到。

1.2.2 樣品的提取與凈化

將飼料用攪碎機(jī)絞碎、研磨，過20目篩，混勻，低溫避光保存。將臥床土樣品自然風(fēng)干（避免陽光直射）后，研磨成粉末，過20目篩，混勻，避光保存。

稱取飼料樣品2.00g（精確至0.01g）于15mL離心管中，加入10mL乙腈，漩渦混勻1min，于25℃下超聲25min，在4℃下以12000r／min離心10 min，上清液收集于15mL離心管內(nèi)，待下一步的凈化處理。

先在NH2固相萃取小柱中加入約2cm高無水硫酸鈉（經(jīng)650℃烘烤4h，保存在干燥器內(nèi)，冷卻后備用），下接旋轉(zhuǎn)瓶放在固定架上。用4mL乙腈-甲苯（3∶1，v／v）淋洗 NH2柱，使其處于活化狀態(tài)。將上清液過柱富集，控制流速在1.00～1.50mL／min范圍，然后用25mL乙腈-甲苯（3∶1，v／v）洗滌小柱，收集所有流出液于旋轉(zhuǎn)瓶中并在40℃水浴中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至近干。用5mL乙腈分3次（2mL＋2 mL＋1mL）洗滌旋轉(zhuǎn)瓶，將洗滌液收集于10mL具塞離心管中，并在40℃條件下用氮?dú)饩徛蹈?。?mL乙腈-甲醇（4∶1，v／v）-0.01%氨水（2∶3，v／v）溶液溶解殘?jiān)?，?jīng)0.22μm濾膜過濾，移入1.5mL自動(dòng)進(jìn)樣器樣品瓶中，供HPLC-MS／MS測(cè)定。

臥床土樣品的前處理方法同上。

1.2.3 HPLC-MS／MS分析條件

HPLC條件 色譜柱:Acquity UPLCTMHSS T3色譜柱（50mm×2.1mm，1.8μm）；流動(dòng)相:乙腈-甲醇（4∶1，v／v）（A）與0.01%氨水（B）。梯度洗脫程序:0～3min，40%A～50%A；3～5min，50%A～80%A，保持 0.5min；5.5～5.6min，80%A～40%A，保持3min；流速:0.3mL／min。柱溫:35℃；樣品溫度:25℃；進(jìn)樣量:10μL。

MS／MS條件 離子源:電噴霧離子源（ESI）；掃描方式:負(fù)離子掃描；檢測(cè)方式:多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；毛細(xì)管電壓:2.37kV；離子源溫度:120℃；脫溶劑氣溫度:450℃；脫溶劑氣（N2）流量:800 L／h；錐孔氣（N2）流量:50L／h；碰撞氣體:氬氣；碰撞氣流速:0.14mL／min。定性離子對(duì)、定量離子對(duì)、去簇電壓（DP）及碰撞能量（CE）見表1。

表1 5種環(huán)境雌激素的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 MS／MS parameters for the determination of the five environmental estrogens

圖1 提取溶劑對(duì)飼料樣品中5種環(huán)境雌激素回收率的影響Fig.1 Influence of extraction solvents on the recoveries of the five environmental estrogens in cow feed

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.1.1 提取溶劑的選擇與優(yōu)化

本文檢測(cè)的5種環(huán)境雌激素都屬于疏水性有機(jī)化合物，易溶于大多數(shù)有機(jī)溶劑。本實(shí)驗(yàn)采用超聲提取方式對(duì)飼料樣品進(jìn)行提取，先后比較了甲醇、叔丁基甲醚、乙腈和乙酸乙酯4種溶劑的提取效果，得到5種環(huán)境雌激素的回收率（見圖1）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，乙腈能有效沉淀樣品中的蛋白質(zhì)，其總提取效率最高，且提取液清澈，本底干擾少；由于飼料本身成分復(fù)雜，含有很多脂溶性化合物，以叔丁基甲醚和乙酸乙酯為提取劑時(shí)混濁現(xiàn)象嚴(yán)重，即使在12000 r／min條件下離心10min也不能很好地消除這種現(xiàn)象，從而造成提取液中含有大量的雜質(zhì)，給后續(xù)的凈化工作帶來了很大的困難，而且乙酸乙酯提取E3的回收率低于20%；除了對(duì)E3外，甲醇的提取效果沒有乙腈好，且甲醇很難與水相分層，提取液中殘存少量雜質(zhì)，不利于凈化過程，易造成固相萃取小柱堵塞。實(shí)驗(yàn)也考察了在提取過程中加入三氯乙酸和0.10%乙酸溶液對(duì)飼料中復(fù)雜基質(zhì)的沉淀效果，以期能得到更純凈的提取液，結(jié)果表明，加入0.10%乙酸溶液的樣品過固相萃取柱時(shí)會(huì)使小柱堵塞；而加入三氯乙酸溶液的樣品提取率反而降低。又采用同樣的辦法對(duì)臥床土樣品進(jìn)行提取，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，4種溶劑的提取效果與飼料樣品的結(jié)果一致。因此，選擇乙腈作為本實(shí)驗(yàn)的提取溶劑。通過考察不同提取溫度（20、25、30 ℃）和超聲時(shí)間（20、25、30min）對(duì)提取效率的影響發(fā)現(xiàn)，在25℃下超聲25min時(shí)提取效率最高，故本實(shí)驗(yàn)選擇在此條件下進(jìn)行提取。

2.1.2 固相萃取柱的選擇

飼料和臥床土的組成成分復(fù)雜，為避免污染色譜柱，減少干擾峰的存在，對(duì)樣品前處理有嚴(yán)格的要求。一般來講，樣品前處理過程復(fù)雜，有的需要有衍生化步驟或者用兩種固相萃取柱連續(xù)過柱。本實(shí)驗(yàn)采用乙腈溶解樣品，超聲離心后，上清液通過活化好的NH2柱，再經(jīng)水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)和氮?dú)獯蹈蓛刹綕饪s，將環(huán)境雌激素全部富集，用初始比例的流動(dòng)相溶液溶解，然后過濾檢測(cè)分析。經(jīng)對(duì)比實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，NH2柱比PEP柱和C18柱的凈化效果好，更適合用于飼料和臥床土中環(huán)境雌激素的富集，得到的目標(biāo)組分回收率均較高（見圖2和圖3），而且大大縮短了前處理時(shí)間。

圖2 不同固相萃取柱對(duì)飼料樣品中環(huán)境雌激素回收率的影響Fig.2 Influence of solid phase extraction columns on the recoveries of the five environmental estrogens in cow feed

2.2 流動(dòng)相的選擇

圖3 不同固相萃取柱對(duì)臥床土樣品中環(huán)境雌激素回收率的影響Fig.3 Influence of solid phase extraction columns on the recoveries of the five environmental estrogens in soil

分別選擇甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.01%氨水、乙腈-0.01%氨水4種體系為流動(dòng)相，結(jié)果顯示，以氨水作為水相比水的效果好，這是由于所檢測(cè)的5種環(huán)境雌激素均為極性物質(zhì)，在以氨水為流動(dòng)相的堿性環(huán)境中，能將5種物質(zhì)的分子變?yōu)楦娴碾x子碎片，從而提高響應(yīng)信號(hào)，使分離效果更為明顯。其中，以甲醇-0.01%氨水為流動(dòng)相時(shí)，5種環(huán)境雌激素的響應(yīng)值雖然很高，但是峰形存在拖尾現(xiàn)象，而且雙酚A與雌二醇的出峰時(shí)間幾乎重合，不能完全分離，影響物質(zhì)的定量；而以乙腈-0.01%氨水為流動(dòng)相時(shí)能將5種物質(zhì)全部分離，并得到很好的峰形，但是各物質(zhì)的響應(yīng)值偏低。故將乙腈和甲醇以不同比例混合，再與0.01%氨水混合作流動(dòng)相，觀察5種物質(zhì)的分離效果和響應(yīng)值。結(jié)果顯示，乙腈-甲醇的配比為4∶1（v／v）時(shí)響應(yīng)值最高，且分離效果最好。由于這5種環(huán)境雌激素的結(jié)構(gòu)不同，所以極性存在細(xì)微差異，在等度條件下洗脫使5種物質(zhì)同時(shí)達(dá)到完全分離需要較長(zhǎng)時(shí)間的穩(wěn)定和平衡，且保留時(shí)間的重現(xiàn)性較差，故本文采用梯度洗脫方式進(jìn)行分離。圖4為在1.2.3節(jié)色譜條件下得到的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖。

2.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

圖4 5種環(huán)境雌激素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.2 mg／L）的色譜圖Fig.4 Chromatogram of a mixed standard solution（0.2 mg／L）of the five environmental estrogens

圖5 （a）雌三醇、（b）雌二醇、（c）雌酮、（d）雙酚 A和（e）己烯雌酚的質(zhì)譜圖Fig.5 MS spectra of（a）estriol，（b）estradiol，（c）estrone，（d）bisphenol A and（e）diethylstilbestrol

將5種環(huán)境雌激素的單標(biāo)準(zhǔn)溶液在m／z 50～500范圍內(nèi)分別在正、負(fù)離子模式下進(jìn)行離子掃描，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這5種物質(zhì)只有在負(fù)離子模式下才有響應(yīng)信號(hào)，故而采用1mg／L的各環(huán)境雌激素標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行流動(dòng)注射分析，以負(fù)離子模式在m／z 50～320掃描范圍內(nèi)優(yōu)化質(zhì)譜參數(shù)。確定5種物質(zhì)的主要離子碎片為:雌三醇m／z287、145、171、143、183；雌二醇m／z271、145、183、143、158；雌酮m／z 269、145、159、183、143；雙酚 A m／z 227、212、133、93、211；己烯雌酚m／z 267、237、251、222、93（見圖5）。其中，雌三醇的碎片離子m／z 287為其分子離子去掉一個(gè)質(zhì)子后形成的準(zhǔn)分子離子峰［M-H］-，m／z 171為準(zhǔn)分子離子失去C6H6-CH2CH2CH3后的產(chǎn)物，其豐度最大，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定；雌二醇的碎片離子m／z 271為其分子離子去掉一個(gè)質(zhì)子后形成的準(zhǔn)分子離子峰［M-H］-，m／z 183.1為準(zhǔn)分子離子失去CH3（CH2）3CH2O的產(chǎn)物，該產(chǎn)物繼續(xù)失去2個(gè)H2O和2個(gè)質(zhì)子后形成豐度最大、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的碎片離子m／z145；雌酮的碎片離子m／z 269為其分子離子去掉一個(gè)質(zhì)子后形成的準(zhǔn)分子離子峰［MH］-，m／z159為分子離子失去CH3（CH2）5CH2O的產(chǎn)物，m／z145則為多失去一個(gè)CH2后形成的豐度最大的離子峰；雙酚A的碎片離子m／z227為其分子離子去掉一個(gè)質(zhì)子后形成的準(zhǔn)分子離子峰［M-H］-，m／z212為準(zhǔn)分子離子峰失去CH3后的離子峰，其豐度最大；己烯雌酚的碎片離子m／z267為其分子離子失去一個(gè)質(zhì)子后形成的準(zhǔn)分子離子峰［M-H］-，m／z251為準(zhǔn)分子離子去掉CH3和一個(gè)質(zhì)子后達(dá)到最大豐度的離子峰。選擇豐度大的m／z145和m／z 171作為雌三醇的監(jiān)測(cè)離子，m／z 183.1和m／z145作為雌二醇的監(jiān)測(cè)離子，m／z159和m／z145作為雌酮的監(jiān)測(cè)離子，m／z 133和m／z 212.1作為雙酚 A的監(jiān)測(cè)離子，m／z 237.1和m／z 251.2作為己烯雌酚的監(jiān)測(cè)離子；選擇其中信噪比較高的離子作為定量離子，故分別以第二個(gè)離子作為每種物質(zhì)的定量離子。按表1選擇1個(gè)母離子和2個(gè)子離子可滿足環(huán)境雌激素的定性要求。當(dāng)兩對(duì)離子對(duì)均出現(xiàn)，且離子對(duì)豐度比與標(biāo)準(zhǔn)溶液中的離子對(duì)豐度比一致時(shí)，則認(rèn)為該組分被檢出。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

分別量取E3、E2、E1、BPA和DES的單一標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（質(zhì)量濃度為1.00g／L）各1.00mL，用甲醇定容于100.00mL容量瓶中，得到質(zhì)量濃度為10.00mg／L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別取適量的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，用乙腈-水（1∶1，v／v）稀釋，配成質(zhì)量濃度依次為5、10、20、50、100、200μg／L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，在優(yōu)化后的色譜、質(zhì)譜條件下，按照質(zhì)量濃度從低到高的順序依次進(jìn)樣，得到不同質(zhì)量濃度時(shí)的峰面積，以質(zhì)量濃度X（μg／L）為橫坐標(biāo)，峰面積Y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。結(jié)果顯示，5種環(huán)境雌激素在5.00～200.00μg／L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.998（見表2）。通過空白樣品添加試驗(yàn)，以S／N＝3和S／N≥10分別求得5種環(huán)境雌激素的方法檢出限（LOD）和方法定量限（LOQ）（見表2）。

表2 5種環(huán)境雌激素的線性方程、檢出限和定量限Table 2 Linear equations，limits of detection（LOD，S／N＝3）and limits of quantification（LOQ，S／N≥10）of the five environmental estrogens

2.5 加標(biāo)回收率和精密度

在飼料和臥床土樣品中均分別添加1.00、2.00、10.00μg／kg 3個(gè)水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照樣品前處理方法進(jìn)行提取和凈化，在優(yōu)化的HPLCMS／MS條件下測(cè)定，每個(gè)添加水平重復(fù)6次測(cè)定，得到樣品中5種環(huán)境雌激素的平均回收率和精密度，檢測(cè)結(jié)果見表3。

2.6 樣品測(cè)定

在上述色譜條件下對(duì)來自11個(gè)養(yǎng)牛場(chǎng)的11份飼料和11份臥床土樣品分別進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果從部分樣品中不同程度地檢出這5種環(huán)境雌激素，其中3份飼料和7份臥床土中檢出雌三醇（含量為2.39～18.95μg／kg），1份飼料和5份臥床土中檢出雌二醇（含量為1.27～4.49μg／kg），2份飼料和11份臥床土中檢出雌酮（含量為1.62～73.97μg／kg），2份飼料和9份臥床土中檢出雙酚A（含量為4.97～30.12μg／kg），3份臥床土中檢出己烯雌酚（含量為1.00～16.04μg／kg），飼料中未檢出己烯雌酚。圖6和圖7分別為其中1份飼料和1份臥床土陽性樣品的色譜圖。

表3 5種環(huán)境雌激素在飼料和臥床土樣品中3個(gè)添加水平下的平均回收率及精密度（n＝6）Table 3 Recoveries and RSDs of the five environmental estrogens spiked in cow feed and soil samples at three different levels（n＝6）

圖6 飼料陽性樣品的色譜圖Fig.6 Chromatogram of a positive cow feed sample

圖7 臥床土陽性樣品的色譜圖Fig.7 Chromatogram of a positive soil sample

本文所測(cè)定的飼料樣品主要分為兩類，一類是泌乳牛濃縮飼料，另一類為配合飼料，其中還混合玉米青貯、麥稈等農(nóng)作物。由于種植農(nóng)作物的微環(huán)境在過去十幾年里受到人為污染和破壞，導(dǎo)致混合飼料中環(huán)境雌激素微量殘留的存在有待進(jìn)一步的調(diào)查和跟蹤。本文所測(cè)定的臥床土樣品也主要分為兩大類，一種為細(xì)沙型臥床土，另一種為奶牛糞便改良農(nóng)用臥床土，并以后者居多。以土壤作為原材料的臥床土中只含有痕量的雌酮和雙酚A，而以牛糞作為原材料的臥床土中含有含量很高的環(huán)境雌激素，主要還是以奶牛內(nèi)源性雌激素雌三醇、雌二醇和雌酮為主。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立了飼料和臥床土中雌三醇、雌二醇、雌酮、雙酚A和己烯雌酚這5種環(huán)境雌激素殘留量的HPLC-MS／MS測(cè)定法。以追溯鮮奶中存在的環(huán)境雌激素來源為目的，檢測(cè)來自不同養(yǎng)殖場(chǎng)的飼料和臥床土，根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，盡管現(xiàn)在養(yǎng)牛場(chǎng)取樣操作嚴(yán)謹(jǐn)，每次都對(duì)奶牛進(jìn)行清洗和消毒，但仍不能完全避免人為操作錯(cuò)誤，故部分養(yǎng)牛場(chǎng)可通過用細(xì)沙型臥床土取代奶牛糞便改良農(nóng)用臥床土的方法，排除可能污染鮮乳的環(huán)節(jié)。該方法具有簡(jiǎn)單快速、靈敏度高和準(zhǔn)確性高的特點(diǎn)，適合于飼料和臥床土樣品中多種環(huán)境雌激素的同時(shí)測(cè)定，并為鮮乳中環(huán)境雌激素的來源分析與追溯提供了一定的參考依據(jù)。

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