亚洲免费av电影一区二区三区,日韩爱爱视频,51精品视频一区二区三区,91视频爱爱,日韩欧美在线播放视频,中文字幕少妇AV,亚洲电影中文字幕,久久久久亚洲av成人网址,久久综合视频网站,国产在线不卡免费播放

        ?

        固相萃取-超高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)檢測(cè)尿樣中的麻黃堿和N-甲基麻黃堿

        2013-10-22 12:56:46張福成王朝虹
        色譜 2013年9期
        關(guān)鍵詞:檢測(cè)

        張 琳,張福成,王朝虹,蔣 曄*,許 萌,李 虹

        (1.河北醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院,河北 石家莊 050017;2.空軍總醫(yī)院,北京 100142;

        3.最高人民檢察院司法鑒定中心,北京 100040;4.云南省公安廳刑警總隊(duì),云南 昆明 650000)

        麻黃堿和N-甲基麻黃堿具有擴(kuò)張支氣管、抗過 敏和鎮(zhèn)咳作用,是感冒藥中的常見成分。其中,麻黃堿具有較強(qiáng)的興奮作用[1],是國際奧委會(huì)嚴(yán)格禁止的興奮劑。因此,體育賽事前確定運(yùn)動(dòng)員是否攝取該類藥物時(shí),常需進(jìn)行尿樣等生物檢材的檢測(cè)。對(duì)于具有器質(zhì)性心臟病的人員,服用含麻黃堿的制劑還可引起意外心律紊亂而致死。此外,二者還是制造苯丙胺類毒品的主要原料,從吸毒人員體內(nèi)采集的血樣、尿樣及毛發(fā)等生物檢材中檢測(cè)該類物質(zhì)是刑偵機(jī)構(gòu)立案的重要依據(jù)。因此,建立快速、靈敏的生物樣品中痕量麻黃堿分析方法,可大大延長(zhǎng)生物檢材的檢測(cè)周期,用于追溯特殊人群的用藥史,對(duì)于藥物的安全使用具有重要意義。

        生物檢材成分復(fù)雜而待測(cè)物含量往往較低,因此常需對(duì)生物樣品中的待測(cè)物進(jìn)行提取、純化和富集,以提高檢測(cè)靈敏度。已報(bào)道的生物樣品前處理方法有稀釋法[2]、蛋白沉淀法[3]、液相萃取法[4-11]、中空纖維液相微萃取法[12]、衍生化法[13-15]、超濾法[16]等。但這些方法均存在一些缺點(diǎn):稀釋法嚴(yán)重污染色譜系統(tǒng);蛋白沉淀法會(huì)導(dǎo)致樣品稀釋,檢測(cè)靈敏度降低;液相萃取操作繁瑣;衍生化法往往受到衍生化效率的限制;中空纖維微液相萃取法的重現(xiàn)性較差;而超濾法存在濃差極化現(xiàn)象,導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果失真。此外,文獻(xiàn)[17-19]報(bào)道了用固相萃取-液相色譜-質(zhì)聯(lián)用的方法檢測(cè)生物樣品中的麻黃堿,檢測(cè)靈敏度為0.1~1μg/L,對(duì)未及時(shí)取樣且濃度極低的樣品往往無法獲得滿意的分析結(jié)果。因此,本文建立了固相萃取-超高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法(SPE-UPLC-ESI MS/MS)聯(lián)用技術(shù)同時(shí)定量測(cè)定尿樣中的痕量麻黃堿和N-甲基麻黃堿。該方法能有效提取、純化和富集待測(cè)物,靈敏度高,結(jié)果準(zhǔn)確。

        1 實(shí)驗(yàn)部分

        1.1 儀器與試劑

        ACQUITY UPLC超高相液相色譜儀,Xevo TQ-MS串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀和MasslynxTM工作站(美國Waters公司)。Milli-Q超純水制造系統(tǒng)(美國Millipore公司);固相萃取儀(美國 Waters公司),Oasis HLB和Oasis MCX固相萃取柱(1mL,30mg;美國 Waters公司)。

        鹽酸麻黃堿(批號(hào):171241- 200404)和鹽酸甲基麻黃堿(批號(hào):171247- 200301)對(duì)照品購于中國藥品生物制品檢定所,純度均大于99.5%;甲醇、乙腈、甲酸均為色譜純,水為超純水,其他試劑均為分析純。

        1.2 尿樣前處理

        尿樣采自健康受試志愿者。精密吸取4mL尿液置于離心管中,加入200μL 5mol/L鹽酸溶液酸化,在離心力8000g條件下離心5min。取上清液過MCX固相萃取柱(預(yù)先分別用1mL甲醇和1 mL水活化、平衡),依次用1mL 0.1mol/L鹽酸溶液、1mL甲醇和1mL 5%(體積百分?jǐn)?shù),下同)氨水溶液淋洗,用1mL甲醇-氨水(95∶5,v/v)溶液洗脫,接收洗脫液,待UPLC-ESI MS/MS分析。

        1.3 色譜與質(zhì)譜條件

        ACQUITY UPLC BEH Phenyl色譜柱(10cm×2.1mm,1.7μm);流動(dòng)相 A為乙腈,流動(dòng)相B為0.3%甲酸溶液。洗脫梯度:0~3min,流動(dòng)相A比例由10%升至55%,4min時(shí)升至90%,4.1min降至10%,保持1.9min。流速:0.4mL/min;柱溫:35℃;樣品室溫度:10℃;進(jìn)樣體積:2μL。

        電噴霧離子源正離子掃描,多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式;毛細(xì)管電壓:3.0kV;離子源溫度:300℃;去溶劑溫度:500℃,去溶劑氣流量:1000L/h;錐孔氣流量:30L/h;碰撞氣流量:0.15mL/min。待測(cè)物的監(jiān)測(cè)離子及駐留時(shí)間、錐孔電壓、碰撞電壓等參數(shù)見表1。

        表1 麻黃堿和N-甲基麻黃堿的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 MS/MS parameters of ephedrine and N-methylephedrine

        2 結(jié)果與討論

        2.1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

        在1.3節(jié)的條件下,混合對(duì)照品溶液、空白尿樣和口服急支糖漿制劑7d后的尿樣分別經(jīng)Oasis MCX固相萃取后的UPLC-MS/MS譜圖見圖1??瞻啄驑又胁缓郎y(cè)物,且空白基質(zhì)對(duì)待測(cè)物的測(cè)定無干擾。

        2.2 色譜條件的選擇

        2.2.1 色譜柱的選擇

        近年來,采用離子對(duì)色譜法分析檢測(cè)生物堿的報(bào)道較多[17],但這給質(zhì)譜檢測(cè)帶來困難。本文在酸性流動(dòng)相(流動(dòng)相B為0.1%甲酸溶液)條件下,分別考察了 HSS SB(5cm)、BEH C18(10cm)、CSH C18(5cm)、BEH Phenyl(10cm)4種色譜柱(柱內(nèi)徑均為2.1mm,填料粒徑均為1.7μm)對(duì)待測(cè)物靈敏度和分離度的影響(見圖2)。結(jié)果表明,以BEH Phenyl色譜柱為分離柱時(shí),待測(cè)物的靈敏度較高,且分離度較好。

        圖1 (a)混合對(duì)照品溶液(1μg/L)、(b)空白尿樣和(c)口服急支糖漿制劑7 d后的尿樣分別經(jīng)MCX柱固相萃取后的UPLC-MS/MS定性和定量離子流譜圖Fig.1 UPLC-MS/MS qualitative and quantitative ion current chromatograms of(a)mixed standard solution(1μg/L),(b)human blank urine,and(c)urine after 7 d administering Jizhi Syrup extracted by MCX solid phase extraction*quantitative ion.

        圖2 不同色譜柱對(duì)待測(cè)物靈敏度的影響Fig.2 Effect of different chromatographic columns on the sensitivity of the analytes

        2.2.2 流動(dòng)相的選擇

        以BEH Phenyl色譜柱作為分離柱,分別考察了酸性流動(dòng)相(流動(dòng)相B為0.1%甲酸溶液)和堿性流動(dòng)相(流動(dòng)相B為10mmol/L碳酸氫銨溶液,pH 10)對(duì)待測(cè)物靈敏度及峰形的影響(見圖3)。結(jié)果表明,待測(cè)物在酸性流動(dòng)相下的靈敏度略高于堿性流動(dòng)相,最終選擇酸性流動(dòng)相。

        圖3 不同流動(dòng)相對(duì)待測(cè)物靈敏度的影響Fig.3 Effect of different mobile phases on the sensitivity of analytes

        圖4 不同甲酸濃度對(duì)待測(cè)物靈敏度的影響Fig.4 Effect of different volume percentages of formic acid on the sensitivity of analytes

        2.2.3 甲酸濃度的選擇

        酸性流動(dòng)相中甲酸的濃度不同,對(duì)待測(cè)物靈敏度及峰形有不同程度的影響,因此以BEH Phenyl色譜柱作為分離柱,分別考察了0.1%甲酸溶液和0.3%甲酸溶液作為流動(dòng)相對(duì)待測(cè)物靈敏度的影響(見圖4)。結(jié)果表明,以0.3%甲酸水溶液作為流動(dòng)相時(shí),待測(cè)物的靈敏度較高,且峰形較好,最終選擇在酸性流動(dòng)相中添加0.3%的甲酸。

        2.3 樣品前處理?xiàng)l件的選擇

        2.3.1 固相萃取柱的選擇

        由于待測(cè)組分呈堿性,在反相色譜填料上的保留很弱,因此很難利用一般的固相萃取小柱達(dá)到萃取的目的。本文考察了含有吸附性填料的Oasis HLB固相萃取柱和兼具離子交換和反相保留的Oasis MCX固相萃取柱對(duì)樣品的提取凈化效果。在不含待測(cè)物的空白尿中分別添加0.0250、0.250和2.50μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,按1.2節(jié)的方法處理樣品,在1.3節(jié)的條件下進(jìn)行測(cè)定,比較樣品的基質(zhì)效應(yīng)(見表2)。

        結(jié)果表明,HLB柱作為萃取柱會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的離子抑制效應(yīng),影響檢測(cè)靈敏度和準(zhǔn)確度,故選擇MCX柱作為固相萃取柱。

        2.3.2 洗脫條件的選擇

        表2 Oasis HLB與Oasis MCX固相萃取柱萃取效果的比較(n=6)Table 2 Comparison of the extraction efficiencies of Oasis HLB and Oasis MCX SPE columns(n=6)

        為了使待測(cè)物在固相萃取柱上得到最好的保留,上樣前需要對(duì)樣品進(jìn)行酸化以保證待測(cè)組分的完全離子化。試驗(yàn)表明,4mL尿液中加入200μL 5 mol/L的鹽酸溶液可保證待測(cè)組分完全吸附在填料上。尿液等生物樣品基質(zhì)非常復(fù)雜,采用質(zhì)譜檢測(cè)時(shí)基質(zhì)效應(yīng)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性影響很大。為了盡可能地去除基質(zhì),本實(shí)驗(yàn)采用酸洗、醇洗和堿洗三步清洗,選擇性除去非極性的中性物質(zhì)、酸性以及極性堿性干擾物,最后采用堿性的甲醇溶液進(jìn)行洗脫??疾炝瞬煌壤募状?氨水溶液的洗脫能力。結(jié)果表明,以甲醇-氨水(95∶5,v/v)溶液作為洗脫液時(shí),待測(cè)物的回收率最高,故選擇其作為洗脫液。

        2.4 線性范圍和檢出限

        配制麻黃堿和N-甲基麻黃堿質(zhì)量濃度為1、2、5、10、20、50、100μg/L的混合對(duì)照品溶液和內(nèi)標(biāo)氘代苯丙胺質(zhì)量濃度為10μg/L的對(duì)照品溶液。吸取上述系列濃度對(duì)照品溶液各250μL至7個(gè)離心管中,分別加入250μL內(nèi)標(biāo)溶液,最后用空白尿稀釋至10mL,配制成質(zhì)量濃度分別為0.0250、0.0500、0.125、0.250、0.500、1.25、2.50μg/L 的樣品溶液。按1.2節(jié)的方法處理樣品,按1.3節(jié)的條件進(jìn)樣測(cè)定,記錄峰面積。以待測(cè)物與內(nèi)標(biāo)峰面積比(Y)對(duì)質(zhì)量濃度(C,μg/L)進(jìn)行線性回歸,得到麻黃堿和N-甲基麻黃堿在0.0250~2.50μg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)的線性方程分別為Y=8.12C-0.143(r=0.9998)和 Y =4.09C+0.735(r=0.9992)。取線性最低點(diǎn)溶液逐倍稀釋,按1.3節(jié)的條件進(jìn)樣測(cè)定,得麻黃堿和N-甲基麻黃堿的檢出限 均 為 0.01 μg/L (S/N = 3),均高于文獻(xiàn)[5-7,12,14-17,19]報(bào)道。

        2.5 精密度、準(zhǔn)確度、基質(zhì)效應(yīng)及提取回收率

        配制麻黃堿和N-甲基麻黃堿低、中、高3個(gè)濃度分別為0.0250、0.250和2.50μg/L的質(zhì)控(QC)樣品,每個(gè)濃度6份,按1.2節(jié)的方法處理樣品,在1.3節(jié)的條件下進(jìn)行測(cè)定,記錄峰面積As,計(jì)算日內(nèi)精密度和準(zhǔn)確度;連續(xù)測(cè)定3d,計(jì)算日間精密度。同時(shí),取空白尿,按1.2節(jié)的方法處理后,配制成低、中、高3個(gè)濃度的溶液,每個(gè)濃度6份,在1.3節(jié)的條件下進(jìn)行測(cè)定,記錄峰面積Am;另取上述3個(gè)濃度的對(duì)照品溶液,不經(jīng)萃取直接進(jìn)樣,記錄峰面積為Astd。以As/Am計(jì)算提取回收率,Am/Astd計(jì)算基質(zhì)效應(yīng),結(jié)果見表3。

        表3 麻黃堿和N-甲基麻黃堿的精密度、準(zhǔn)確度、基質(zhì)效應(yīng)及提取回收率(n=6)Table 3 Precisions,accuracies,matrix effects and recoveries of ephedrine and N-methylephdrine(n=6)

        2.6 樣品穩(wěn)定性

        配制麻黃堿和N-甲基麻黃堿低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度分別為0.0250、0.250和2.50μg/L的質(zhì)控樣品,每個(gè)濃度3份。將上述樣品于室溫放置24h及經(jīng)過3次凍融循環(huán)后,按1.2節(jié)方法處理,并在1.3節(jié)的條件下進(jìn)行測(cè)定,考察其短期穩(wěn)定性及凍融穩(wěn)定性(見表4)。結(jié)果表明,麻黃堿和N-甲基麻黃堿在上述條件下均穩(wěn)定。

        表4 麻黃堿和N-甲基麻黃堿的穩(wěn)定性(n=3)Table 4 Stabilities of ephedrine and N-methylephedrine(n=3)

        2.7 真實(shí)樣品測(cè)定

        采集健康志愿者口服10mL急支糖漿制劑7d后的尿樣,按1.2節(jié)方法處理樣品,并按1.3節(jié)的條件進(jìn)行測(cè)定,尿樣中麻黃堿和N-甲基麻黃堿的質(zhì)量濃度分別為0.034和0.137μg/L。表明該方法能夠有效測(cè)定尿樣中痕量的麻黃堿和N-甲基麻黃堿,大大提高檢測(cè)靈敏度,并延長(zhǎng)了尿樣中麻黃堿和N-甲基麻黃堿的檢測(cè)周期。

        3 結(jié)論

        本實(shí)驗(yàn)采用Oasis MCX固相萃取柱對(duì)尿樣進(jìn)行提取、純化和富集,建立了SPE-UPLC-ESI MS/MS方法分析尿樣中痕量麻黃堿和N-甲基麻黃堿,顯著提高了檢測(cè)靈敏度,大大延長(zhǎng)了尿樣中麻黃堿和N-甲基麻黃堿的檢測(cè)周期,為未及時(shí)取樣且濃度極低的樣品中痕量麻黃堿和N-甲基麻黃堿的檢測(cè)提供了有效的方法。

        [1]Abourashed E A,El-Alfy A T,Khan I A,et al.Phytother Res,2003,17:703

        [2]Li K,Chen J,Xu X,et al.Chinese Journal of Pharmaceuticals(李坤,陳鈞,徐新,等.中國醫(yī)藥工業(yè)雜志),2009,40(9):695

        [3]Feng Y,Huang Y,Lai W L,et al.Journal of Guangdong College of Pharmacy(馮怡,黃羽,賴偉玲,等.廣東藥學(xué)院學(xué)報(bào)),2008,24(6):572

        [4]Ren L,Deng X X,Bi K S,et al.Chinese Journal of Pharmaceutical Analysis(任磊,鄧新秀,畢開順,等.藥物分析雜志),2007,27(10):1544

        [5]Liu Q Y,Zhang Z H,Chen B,et al.Journal of Instrumental Analysis(劉慶艷,張朝輝,陳波,等.分析測(cè)試學(xué)報(bào)),2008,27(1):26

        [6]Li S G,Li H Y,Cai Z,et al.Chinese Journal of Analytical Chemistry(李斯光,李海燕,蔡卓,等.分析化學(xué)),2009,37(8):1137

        [7]Wang L L,F(xiàn)ang Y,Ge W H.China Pharmacy(王璐璐,方蕓,葛衛(wèi)紅.中國藥房),2007,18(32):2510

        [8]Hu Z,Zou Q,Tian J,et al.J Chromatogr B,2011,879:3937

        [9]Wang P Y,Zhang H M,Wang C F,et al.Chinese Journal of Information on TCM(王朋義,張海鳴,王成芳,等.中國中醫(yī)藥信息雜志),2012,19(1):56

        [10]Zheng Z,Yan T,Chen W,et al.Xenobiotica,2012,42(8):775

        [11]Salam R A A,Hadad G M,Hameed E A A.J Liq Chromatogr Relat Technol,2013,36:384

        [12]Chen X,Bai X H,Wang X,et al.Chinese Journal of Chromatography(陳璇,白小紅,王曉,等.色譜),2010,28(12):1144

        [13]LeBelle M J,Savard C,Dawson B A,et al.Forensic Science International,1995,71:215

        [14]Herráez-Hernández R,Campíns-FalcóP.J Chromatogr A,2000,893:69

        [15]Aymard G,Labarthe B,Warot D,et al.J Chromatogr B,2000,744:25

        [16]Sorensen L K.J Chromatogr B,2011,879:727

        [17]Chen X H,Li X P,Yao X P.Chinese Journal of Health Laboratory Technology(陳曉紅,李小平,姚潯平.中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志),2006,16(6):691

        [18]He Y N,Hu Y Q,Yang H Y,et al.China Pharmacy Journal(何穎娜,胡玉欽,楊漢煜,等.中國藥學(xué)雜志),2009,44(6):464

        [19]Chen X H,Qiu P H,Jin M C et al.Physical Testing and Chemical Analysis Part B:Chemical Analysis(陳曉紅,仇佩虹,金米聰,等.理化檢驗(yàn):化學(xué)分冊(cè)),2006,42(10):790

        猜你喜歡
        檢測(cè)
        QC 檢測(cè)
        “不等式”檢測(cè)題
        “一元一次不等式”檢測(cè)題
        “一元一次不等式組”檢測(cè)題
        “幾何圖形”檢測(cè)題
        “角”檢測(cè)題
        “有理數(shù)的乘除法”檢測(cè)題
        “有理數(shù)”檢測(cè)題
        “角”檢測(cè)題
        “幾何圖形”檢測(cè)題
        欧美乱妇高清无乱码免费| 日本色偷偷| 白色橄榄树在线阅读免费| 亚洲精品一品区二品区三区| 中文字幕无码毛片免费看| 久久香蕉国产线看观看网| 日韩偷拍视频一区二区三区| 精品日本一区二区三区| 国产肉体xxxx裸体784大胆| 亚洲精品无码久久毛片| 福利一区二区三区视频在线 | 国产夫妻av| 亚洲精品国产二区在线观看| 亚洲av无码精品无码麻豆| 国产人妻精品一区二区三区| 国产精品大屁股1区二区三区| 中文字幕久久人妻av| 高黄暴h日本在线观看| 国产麻豆精品久久一二三| 国产精品美女黄色av| 亚洲美女一区二区三区三州| 偷看农村妇女牲交| 性一交一乱一伦| 日韩精品中文字幕综合| 亚洲国产综合久久天堂| 女邻居的大乳中文字幕| 国产精品27页| 91精品亚洲熟妇少妇| 国产乱子轮xxx农村| 亚洲欧美成人a∨| 国产一级r片内射视频播放| 爽爽影院免费观看| 少妇人妻200篇白洁| 欧美人与动牲交片免费| 男性av天堂一区二区| 在线 | 一区二区三区四区| 欧美成人中文字幕| 在线观看视频亚洲一区二区三区| 久久精品无码一区二区日韩av| 国产成人av一区二区三区无码 | 亚洲高清一区二区精品|