薛成俊 周忠海 陳復興 呂小婷 李瑩 費素娟

·論著·

氫化可的松對人NK細胞增殖及其對胰腺癌SW1990細胞殺傷效率的影響

薛成俊 周忠海 陳復興 呂小婷 李瑩 費素娟

目的探討氫化可的松對人外周血NK細胞增殖及其對胰腺癌SW1990細胞殺傷力的影響。方法分離健康人外周血單個核細胞加入到含IL-15細胞因子的NK細胞培養(yǎng)基中誘導培養(yǎng)NK細胞。當NK細胞純度達到70%以上時，加入10-6、10-5、10-4、10-3μmol/L氫化可的松繼續(xù)培養(yǎng)7 d。以未加氫化可的松的NK細胞作為對照組。采用錐蟲藍染色計數(shù)細胞；采用流式細胞術檢測CD3-CD56+NK細胞含量及其穿孔素、顆粒酶B和IFN-γ的表達；以20∶1的效靶比將NK細胞與SW1990細胞共培養(yǎng)，用細胞增殖-毒性檢驗法(CCK-8)檢測NK細胞對SW1990細胞的殺傷效應。結果用氫化可的松處理7 d后NK細胞量平均達到70.72%～76.39%，與對照組的(72.61±3.76)%差異無統(tǒng)計學意義；10-6、10-5、10-4、10-3μmol/L氫化可的松處理組NK細胞的增殖倍數(shù)分別為(9.13±0.94)、(9.67±1.51)、(10.33±1.07)、(8.40±1.47)倍，均顯著高于對照組的(4.23±0.82)倍(P值均<0.01)；NK細胞對SW1990細胞的殺傷效率分別為(58.58±4.89)%、(62.27±5.63)%、(64.02±5.79)%、(63.88±3.61)%，均較對照組的(57.46±5.11)%增強，其中10-4μmol/L組的差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；10-4、10-3μmol/L氫化可的松處理組NK細胞穿孔素表達分別為(96.71±3.04)%、(97.56±2.18)%，顯著高于對照組的(92.40±3.53)%(P<0.05或0.01)；10-5μmol/L氫化可的松處理組NK細胞的顆粒酶B表達為(78.23±2.94)%，顯著高于對照組(73.68±3.52)%(P<0.05)；10-5、10-4、10-3μmol/L 氫化可的松處理組NK細胞IFN-γ表達分別為(96.61±2.04)%、(97.58±2.17)%、(98.00±1.77)%，均顯著高于對照組的(92.44±2.74)%(P值均<0.01)。結論氫化可的松可促進IL-15活化的NK細胞增殖，適當濃度條件下增強對SW1990細胞殺傷活性，其機制可能與其穿孔素、顆粒酶B和IFN-γ表達上調(diào)有關。

氫化可的松; 殺傷細胞，天然; 胰腺腫瘤; 細胞增殖; 殺傷活性

NK細胞是機體固有免疫重要的淋巴細胞，它通過分泌IFN-γ、IL-2和TNF-α等細胞因子和趨化因子啟始和調(diào)節(jié)機體的免疫反應[1]，無需通過抗原預先刺激即可直接殺傷腫瘤和病毒感染的靶細胞，是腫瘤免疫治療重要的效應細胞[1-2]。氫化可的松(hydrocortisone, HC)屬糖皮質(zhì)激素，不僅具有免疫抑制作用，而且對免疫系統(tǒng)可能有正性調(diào)節(jié)作用，這取決于免疫系統(tǒng)淋巴細胞的活化狀態(tài)[3]。因此，本研究觀察HC對NK細胞體外增殖及殺傷胰腺癌SW1990細胞效率的影響，為培養(yǎng)更高數(shù)量和功能活性的NK細胞用于腫瘤過繼性免疫治療提供實驗依據(jù)。

材料與方法

一、外周血NK細胞培養(yǎng)

8例外周血標本采自健康獻血員，其中男性5人，女性3人，年齡23～48歲，中位年齡35歲。經(jīng)人淋巴細胞分離液梯度密度離心獲得外周血單個核細胞(PBMCs)，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次，調(diào)整細胞密度為5×105/ml，加入含IL-15 (廈門特寶生物工程公司)500 U、5%自身血清的NK細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)10 d，收集細胞進行CD3-CD56+NK細胞表型鑒定，獲取有效擴增的NK細胞。調(diào)整有效擴增的NK細胞密度為5×105/ml，分別加入10-6、10-5、10-4、10-3μmol/L的HC，置37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d。以未加HC的作為對照組。

二、NK細胞表型鑒定

收集各組細胞，用PBS洗滌2次，計數(shù)細胞，調(diào)整細胞密度為1×107/ml。取100 μl 細胞懸液，分別加入20 μl 異硫氰酸熒光素(FITC)標記的anti-CD56和藻紅蛋白(PE)標記的anti-CD3室溫避光孵育15 min，PBS洗滌2遍，加入400 μl PBS重懸細胞，流式細胞術檢測各組NK細胞的百分含量。

三、NK細胞增殖倍數(shù)

收集各組NK細胞，用PBS洗滌后錐蟲藍染色計數(shù)細胞總數(shù)，結合流式細胞術細胞純度檢測結果，NK細胞增殖倍數(shù)=HC干預后細胞數(shù)×NK細胞含量(%)/HC干預前細胞數(shù)×NK細胞含量(%)。

四、NK細胞穿孔素、顆粒酶B和IFN-γ表達的檢測

收集各組NK細胞，用PBS洗滌2次，調(diào)整細胞密度為1×107/ml。每組取3管100 μl 細胞懸液，加入20 μl FITC標記的anti-CD56和PerCP-Cy5.5標記的anti-CD3(BD公司)，室溫避光孵育15 min，加入100 μl破膜試劑A(Invitrogen公司)室溫避光孵育15 min，PBS洗滌后再加入100 μl破膜試劑B(Invitrogen公司)，同時在穿孔素測定管中加入5 μl PE標記的anti-Perforin(eBioscience公司)，顆粒酶B測定管中加入20 μl PE標記的anti-Granzyme B(eBioscience公司)，IFN-γ測定管中加入5 μl 別藻青蛋白(APC)標記的anti-IFN-γ(BD公司)，室溫避光孵育15 min，PBS洗滌，以400 μl PBS重懸細胞，上流式細胞儀檢測穿孔素、顆粒酶B和IFN-γ的表達，結果以百分值表示。

五、NK細胞對SW1990細胞殺傷效率的檢測

人胰腺癌SW1990細胞購自中國科學院上海生命科學研究所細胞資源中心，常規(guī)培養(yǎng)、傳代。取對數(shù)生長期SW1990細胞作為靶細胞，以5×103/孔的密度接種于96孔板，以20∶1的效靶比分別加入不同濃度HC干預培養(yǎng)7 d的NK細胞，總體積為200 μl/孔，同時設各濃度組的空白對照組、效應細胞對照組和靶細胞對照組，每組設3個復孔。效應細胞與靶細胞共孵育24 h后加入CCK-8溶液(碧云天生物技術公司)20 μl/孔，繼續(xù)孵育4 h后上酶聯(lián)免疫分析儀測每孔450 nm處吸光度值(A450值)。殺傷活性(%)=[1-(實驗組A450值-效應細胞對照組A450值)/ 靶細胞對照組A450值]×100%。

六、統(tǒng)計學處理

結 果

一、NK細胞培養(yǎng)表型鑒定

10-6、10-5、10-4、10-3μmol/L HC處理7 d后，CD3-CD56+的NK細胞量分別為(72.14±3.51)%、(71.75±2.36)%、(70.83±2.90)%、(69.88±4.14)%，與對照組的(72.61±3.76)%差異無統(tǒng)計學意義(t值分別為0.258，0.548，1.060，1.381，P值均>0.05，圖1)。

圖1對照組(左)、10-5μmol/L氫化可的松處理組(右)CD3-CD56+的NK細胞量

二、NK細胞增殖力的變化

10-6、10-5、10-4、10-3μmol/L HC處理7 d后，NK細胞增殖倍數(shù)分別為(9.13±0.94)、(9.67±1.51)、(10.33±1.07)、(8.40±1.47)倍，較對照組的(4.23±0.82)倍顯著增高(t值分別為11.111，8.955，12.799，7.007，P值均<0.01)。

三、NK細胞對SW1990細胞的殺傷效率

10-6、10-5、10-4、10-3μmol/L HC處理7 d后，NK細胞對SW1990細胞的殺傷效率在效靶比20∶1時分別為(58.58±4.89)%、(62.27±5.63)%、(64.02±5.79)%、(63.88±3.61)%，較對照組的(57.46±5.11)%增強，其中10-4μmol/L HC處理組的差異具有統(tǒng)計學意義(t值分別為0.448，1.789，2.403，2.902，P值均<0.05)。

四、NK細胞穿孔素、顆粒酶B和IFN-γ的表達

10-5μmol/L HC處理組NK細胞的顆粒酶B和IFN-γ表達顯著高于對照組，10-4、10-3μmol/L HC處理組NK細胞穿孔素和IFN-γ的表達均顯著高于對照組(表1、圖2)。

組別穿孔素顆粒酶BIFN-γ對照組92.40±3.5373.68±3.5292.44±2.7410-6μmol/LHC組90.59±5.8275.03±3.1995.03±2.5210-5μmol/LHC組92.67±3.4978.23±2.94a96.61±2.04b10-4μmol/LHC組96.71±3.04a77.75±3.8497.58±2.17b10-3μmol/LHC組97.56±2.18b74.28±4.1598.00±1.77b

注：與對照組比較，aP<0.05，bP<0.01

圖2同型對照組(左)、對照組(中)、10-4μmol/L氫化可的松處理組(右)NK細胞的穿孔素(上)、顆粒酶B(中)和INF-γ(下)表達

討 論

NK細胞是不同于T、B細胞的一類大顆粒淋巴細胞亞群，在外周血中含量相對較少，約占外周血淋巴細胞10%～15%，具有抗腫瘤、抗感染和免疫調(diào)節(jié)等功能，且不受組織相容性復合物(MHC)的限制，是機體重要的固有免疫細胞，同時還具有適應性免疫的特性[4]。動物實驗和臨床腫瘤過繼免疫治療研究結果表明，基于NK細胞的過繼性免疫治療是安全有效的[5-7]，有望成為臨床腫瘤細胞免疫治療的重要手段。

鑒于體外擴增的NK細胞具有較高的抗腫瘤活性[8-10]和HC對免疫系統(tǒng)的雙相調(diào)節(jié)作用，本研究先選擇IL-15活化擴增NK細胞，然后用不同濃度的HC處理NK細胞7 d，結果經(jīng)HC處理各組NK細胞百分含量并沒有顯著性的變化，但增殖倍數(shù)卻顯著高于未加HC處理的對照組，這表明HC促進了IL-15活化的NK細胞的體外擴增，其作用機制可能是HC增強了NK細胞表面IL-15R的表達，從而放大了IL-15及其受體介導的信號轉導途徑[11]。

穿孔素是NK細胞胞質(zhì)中的細胞毒顆粒，可在靶細胞膜上形成管狀跨膜通道，致靶細胞裂解。顆粒酶B是NK細胞顆粒中重要的絲氨酸蛋白酶，通過穿孔素在靶細胞膜上形成的通道進入靶細胞，激活凋亡相關酶系統(tǒng)致細胞凋亡。穿孔素/顆粒酶途徑和IFN-γ等細胞因子產(chǎn)生和分泌是NK細胞殺傷靶細胞的重要機制[12-13]。本研究結果表明，HC與IL-15共同誘導培養(yǎng)后，NK細胞穿孔素、顆粒酶B及IFN-γ的表達增強，提示HC處理后的IL-15活化的NK細胞殺傷腫瘤細胞的功能沒有受到負面的影響，而是不同程度地增強。

胰腺癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，發(fā)病率呈逐年上升趨勢，高居惡性腫瘤死亡病因的第5位，手術切除后的生存率偏低[14]，因此本研究選擇胰腺癌SW1990細胞進行體外殺傷研究。結果表明不同濃度HC處理后NK細胞對SW1990細胞的殺傷能力增強，其中10-4μmol/L HC處理組與無HC處理的對照組的差異具有統(tǒng)計學意義，與Moustaki等[15]結果基本一致。HC處理的NK細胞保持了原有的腫瘤細胞殺傷活性并略有增加，這可能與HC和IL-15共培養(yǎng)后NK細胞穿孔素、顆粒酶B及IFN-γ的表達上調(diào)有關，是否影響其他與NK細胞殺傷腫瘤細胞相關的分子機制以及HC干預培養(yǎng)的NK細胞用于臨床治療的安全性和有效性還有待于進一步研究。

[1] Sutlu T, Alici E. Natural killer cell-based immunotherapy in cancer: current insights and future prospects. J Intern Med, 2009, 266:154-181.

[2] Lapteva N, Durett AG, Sun J, et al. Large-scale ex vivo expansion and characterization of natural killer cells for clinical applications. Cytotherapy, 2012, 14:1131-1143.

[3] Perez SA, Mahaira LG, Demirtzoglou FJ, et al. A potential role for hydrocortisone in the positive regulation of IL-15-activated NK-cell proliferation and survival. Blood, 2005, 106:158-166.

[4] Sun JC, Beilke JN, Lanier LL. Adaptive immune features of natural killer cells. Nature, 2009, 457:557-561.

[5] Ni J, Miller M, Stojanovic A, et al. Sustained effector function of IL-12/15/18-preactivated NK cells against established tumors. J Exp Med, 2012, 209:2351-2365.

[6] Geller MA,Cooley S,Judson PL,et al.A Phase Ⅱ study of allogeneic natural killer cell therapy to treat patients with recurrent ovarian and breast cancer.Cytotherapy,2011,13:98-107.

[7] Arai S, Meagher R, Swearingen M, et al. Infusion of the allogeneic cell line NK-92 in patientswith advanced renal cell cancer or melanoma: a phase I trial. Cytotherapy, 2008,10:625-632.

[8] Spanholtz J, Tordoir M, Eissens D, et al. High log-scale expansion of functional human natural killer cells from umbilical cord blood CD34-positive cells for adoptive cancer immunotherapy. PLoS One, 2010, 5:e9221.

[9] Vacca P, Martini S, Garelli V, et al. NK cells from malignant pleural effusions are not anergic but produce cytokines and display strong antitumor activity on short-term IL-2 activation. Eur J Immunol, 2013, 43:550-561.

[10] Kim EK, Ahn YO, Kim S, et al. Ex vivo activation and expansion of natural killer cells from patients with advanced cancer with feeder cells from healthy volunteers. Cytotherapy, 2013,15:231-241.

[11] Fehniger TA, Caligiuri MA. Interleukin 15: biology and relevance to human disease. Blood, 2001, 97:14-32.

[12] Aktas E, Kucuksezer UC, Bilgic S, et al. Relationship between CD107a expression and cytotoxic activity. Cell Immunol, 2009, 254:149-154.

[13] Sarhan D, D′Arcy P, Wennerberg E, et al. Activated monocytes augment TRAIL-mediated cytotoxicity by human NK cells through release INF-γ. Eur J Immunol, 2013, 43:249-257.

[14] 金鋼, 邵卓, 胡先貴, 等. 胰腺癌2061例外科手術的療效與預后分析, 中華胰腺病雜志, 2013, 13:1-4.

[15] Moustaki A, Argyropoulos KV, Baxevanis CN, et al. Effect of the simultaneous administration of glucocorticoids and IL-15 on human NK cell phenotype, proliferation and function. Cancer Immunol Immunother, 2011, 60:1683-1695.

EffectofhydrocortisoneonproliferationandkillingactivityofNKcellsagainstSW1990cells

XUECheng-jun,ZHOUZhong-hai,CHENFu-xing,LüXiao-ting,LIYing,FEISu-juan.

DepartmentofGastroenterology,AffiliatedHospitalofXuzhouMedicalCollege,Xuzhou221002,China

Correspondingauthor:FEISu-juan,Email:feisj1031@yahoo.com.cn

ObjectiveTo investigate the effects of hydrocortisone (HC) on proliferation and killing activity of NK cells against pancreatic cancer SW1990 cells in vitro.MethodsPeripheral blood mononuclear cells of healthy people were isolated and cultured with NK cells medium containing IL-15. When the purity of NK cells reached above 70%, different concentrations of HC (10-6, 10-5, 10-4, 10-3μmol/L) were added and co-cultured with NK cells for 7 days. And NK cells without HC were used as control. CD3-CD56+NK cell numbers of each group were countered by trypan blue staining. Perforin, granzyme B and IFN-γ expression of CD3-CD56+NK cells were verified by flow cytometry. NK cells and SW1990 cells were co-cultured with a 20∶1 effector to target ratio, then the cytotoxic activity of NK cells against SW1990 cells were analyzed by CCK-8 kit.ResultsAfter treatment with different concentration of HC for 7 days, NK cells purity of each group reached 70.72%～76.39%, and it was not significantly different with that in control group [(72.61±3.76)%]. The proliferation folds of NK cells treated with 10-6, 10-5, 10-4, 10-3μmol/L HC were (9.13±0.94), (9.67±1.51), (10.33±1.07), (8.40±1.47) times, respectively, while it was (4.23±0.82) times in control group (allP<0.01). The killing effects of NK cells on SW1990 cells were (58.58±4.89)%, (62.27±5.63)%, (64.02±5.79)%, (63.88±3.61)%, which were higher than that in control group [(57.46±5.11)%], moreover, the difference between NK cells of 10-4μmol/L HC treatment group and control group was statistically significant(P<0.05). The expressions of perforins of 10-4, 10-3μmol/L HC treatment group were (96.71±3.04)%, (97.56±2.18)%, which were significantly higher than that in control group [(92.40±3.53)%,P<0.05 or 0.01]. The expression of granzyme B in 10-5μmol/L HC treatment group was (78.23±2.94)%, which were significantly higher than that in control group [(73.68±3.52)%,P<0.05]. The expressions of IFN-γ in 10-5, 10-4, 10-3μmol/L HC treatment group were (96.61±2.04)%, (97.58±2.17)%, (98.00±1.77)%, which were significantly higher than that in control group [(92.44±2.74)%,P<0.01].ConclusionsHC can promote IL-15 activated NK cells proliferation and enhance NK cells mediated killing activity against SW1990 cells with proper concentration, and up-regulation of perforin, granzyme B and IFN-γ expression may be the main mechanisms.

Hydrocortisone; Killer cell, natural; Pancreatic neoplasms; Cell proliferation; Killing activity

2013-03-20)

(本文編輯：呂芳萍)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2013.03.009

221002 江蘇徐州，徐州醫(yī)學院附屬醫(yī)院消化內(nèi)科(薛成俊、費素娟)；南通大學附屬建湖醫(yī)院消化內(nèi)科(薛成俊)；解放軍第97醫(yī)院中心實驗室(周忠海、陳復興、呂小婷、李瑩)

費素娟,Email: feisj1031@yahoo.com.cn