張 旭 鹿 蕾 張 勉 張 婧 王艷麗 王美青

第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院解剖生理學(xué)教研室，陜西西安 710032

用干細(xì)胞移植治療疾病是當(dāng)今醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)之一[1-2]，但移植后如何從受體辨別供體細(xì)胞，并觀察其在活體內(nèi)的生存遷徙情況，一直是困擾其臨床應(yīng)用的瓶頸之一[3]。超順磁性納米鐵粒子（superparamagnetic iron nanoparticle，SPIO）可作為磁共振成像分子探針標(biāo)記骨髓基質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow stem cells，BMSCs）[3]，從而能夠檢測活體內(nèi)細(xì)胞的遷徙、代謝和生物學(xué)行為。本實(shí)驗(yàn)以超順磁性納米鐵粒子標(biāo)記大鼠BMSCs，檢測其對細(xì)胞生物學(xué)特性的影響并探討不同濃度SPIO標(biāo)記大鼠BMSCs的生物學(xué)特性和生命狀態(tài)，為BMSCs的活體內(nèi)示蹤研究提供重要依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

以4周齡雌性SD大鼠（體重約120 g，由第四軍醫(yī)大學(xué)動物中心提供）為實(shí)驗(yàn)動物，主要試劑：DMEM/F12培養(yǎng)基、復(fù)合膠原酶 NB4、胎牛血清（FBS）、0.25%胰蛋白酶、納米鐵（由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院醫(yī)學(xué)影像中心惠贈）、亞鐵氰化鉀、鹽酸。主要儀器：倒置相差顯微鏡、JENM1220型透射電鏡。

1.2 SD大鼠BMSCs的分離培養(yǎng)與鑒定

取大鼠雙側(cè)脛骨及股骨，用無血清DMEM培養(yǎng)基反復(fù)沖洗骨髓腔，將沖洗獲得的細(xì)胞懸液離心，取細(xì)胞沉淀，加入適量含10%胎牛血清的低糖型DMEM/F12培養(yǎng)基，置于5%CO2、37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。多次換液傳代使BMSCs純化，取第4代細(xì)胞進(jìn)行爬片，4%多聚甲醛固定后行HE染色，光鏡下觀察。取培養(yǎng)的第5代細(xì)胞，吹打?yàn)閱渭?xì)胞懸液接種，進(jìn)行細(xì)胞爬片。磷酸緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）洗去培養(yǎng)液，4%多聚甲醛固定15 min，以封閉液（PBS含1%牛血清白蛋白，0.1%Triton）室溫下封閉30 min，加入兔抗小鼠 CD45，CD105，CD166，CD90 抗體 4°C 過夜后室溫30 min，PBS洗滌3次，每遍5 min，然后以CY3聯(lián)抗兔抗體室溫下避光孵育 1 h，DAPI室溫（1∶500）染核 5 min，PBS洗滌3次，每遍5 min，加熒光保護(hù)劑，激光共聚焦觀察 CD45、CD105、CD166、CD90 的表達(dá)。

1.3 SPIO標(biāo)記BMSCs的制備與鑒定

1.3.1 SPIO-BMSCs制備

取對數(shù)生長期的BMSCs，反復(fù)吹打成單細(xì)胞懸液。以5×105/mL的密度接種到含有不同濃度SPIO的20%胎牛血清DMEM/F12培養(yǎng)基中孵育。SPIO濃度分別為15、25、50 mg/L，5%CO2、37°C 培養(yǎng) 48 h。 不含 SPIO 的 20%胎牛血清培養(yǎng)基為對照。

1.3.2 SPIO-BMSCs鑒定

1.3.2.1 普魯士藍(lán)染色 用不同濃度SPIO標(biāo)記的BMSCs制備細(xì)胞爬片，4%多聚甲醛固定15 min，PBS洗3次，放入Pearl液（含2%亞鐵氰化鉀和6%鹽酸溶液）中常溫孵育30 min，蒸餾水洗滌，顯微鏡下觀察。以未標(biāo)記細(xì)胞作對照。

1.3.2.2 透射電鏡檢查 標(biāo)記后BMSCs經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化，1500 r/min離心10 min后棄上清液，向細(xì)胞沉淀中加入2.5%戊二醛液固定30 min，再用1%鋨酸固定30 min，0.5%醋酸鈾4°C染色固定過夜，梯度乙醇脫水，EP812包埋。超薄切片，醋酸鈾復(fù)染，透射電鏡觀察。

1.4 SPIO-BMSCs的生物學(xué)特性檢測

1.4.1 SPIO-BMSCs的存活

分別將15、25、50 mg/L濃度SPIO標(biāo)記培養(yǎng)的第4代BMSCs單細(xì)胞懸液與臺藍(lán)染色液以9∶1的比例混勻，靜置3 min，光鏡下計數(shù)，死細(xì)胞為藍(lán)色，活細(xì)胞不著色，計數(shù)200個細(xì)胞，計算活細(xì)胞百分比。設(shè)未標(biāo)記SPIO的細(xì)胞對照組。

1.4.2 SPIO-BMSCs增殖活性

用MTT法繪制生長曲線，將各濃度的SPIO標(biāo)記前后的細(xì)胞懸液接種于96孔板，每孔200 μL，設(shè)5個復(fù)孔。分別于第 1、3、5、7 d 取 5 孔，加入 MTT 液，在 5%CO2、37°C培養(yǎng)4 h后取出，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清，每孔加入150 μL DMSO。振蕩10 min，用酶標(biāo)儀在490 nm處側(cè)出吸光度A值。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行處理。計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間均數(shù)比較采用方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞生長情況

原代細(xì)胞48 h半換液，見大量懸浮細(xì)胞，在瓶底可見單個細(xì)胞貼壁生長，多為短多角形。個別細(xì)胞偽足伸長，4 d全量換液，PBS漂洗，去除大量漂浮的細(xì)胞，可見分散的BMSCs成簇生長為集落狀，細(xì)胞逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)殚L梭形，紡錘狀，胞核為圓形或橢圓形，胞漿內(nèi)可見較多的顆粒（圖1a）。10 d左右細(xì)胞大部分融合，達(dá)90%以上，細(xì)胞形態(tài)均勻，長梭形，排列緊密，呈旋渦狀，有一定的方向性。傳代后，細(xì)胞形態(tài)類似纖維狀，排列更加整齊（圖1b）。

2.2 BMSCs的免疫熒光鑒定

BMSCs經(jīng)免疫熒光染色，絕大多數(shù)細(xì)胞呈CD105、CD166、CD90（間質(zhì)干細(xì)胞特征性標(biāo)志物）陽性，CD45呈陰性。見圖2。

2.3 SPIO-BMSCs標(biāo)記鑒定

2.3.1 普魯士藍(lán)鐵染色

普魯士藍(lán)染色見細(xì)胞染色陽性率＞99%，表現(xiàn)為細(xì)胞內(nèi)有大量藍(lán)染顆粒，部分聚集成團(tuán)，顆粒分布以核周和靠近細(xì)胞膜處較為明顯（圖3）。

2.3.2 透射電鏡檢查

透射電鏡觀察標(biāo)記的細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)見高電子密度顆粒聚集，主要位于各級溶酶體內(nèi)（圖4）。

2.4 SPIO-BMSCs活性

2.4.1 臺藍(lán)染色SPIO-BMSCs活細(xì)胞計數(shù)

實(shí)驗(yàn)組1的SPIO濃度為15 mg/L時，活細(xì)胞比率與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），但在實(shí)驗(yàn)組2和實(shí)驗(yàn)組3，當(dāng)SPIO濃度為25、50 mg/L時活細(xì)胞比率有所降低（P ＜ 0.05）。 見表1。

2.4.2 細(xì)胞增殖活性檢測

MTT結(jié)果顯示，SPIO的濃度為15 mg/L時對細(xì)胞增殖無明顯影響（P＞0.05），而當(dāng)SPIO的濃度為25、50 mg/L時，細(xì)胞增殖受到明顯抑制（P＜0.05）。見圖4。

表1 實(shí)驗(yàn)組與對照組的活細(xì)胞比率結(jié)果（%，±s）

表1 實(shí)驗(yàn)組與對照組的活細(xì)胞比率結(jié)果（%，±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05

組別 1 d 2 d 3 d 4 d 5 d 6 d實(shí)驗(yàn)組1實(shí)驗(yàn)組2實(shí)驗(yàn)組3對照組98.12±0.21 95.76±0.36*92.11±0.21*97.98±0.24 97.86±0.21 94.49±0.56*93.12±0.31*98.11±0.21 97.43±0.28 93.12±0.19*91.12±0.67*96.98±0.65 96.82±0.19 94.89±0.76 92.43±0.37*95.67±0.34 98.21±0.67 93.43±0.46*90.98±0.43*96.94±0.54 97.12±0.31 94.29±0.19*91.01±0.54*97.32±0.34

3 討論

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在體外特定的誘導(dǎo)條件下或體內(nèi)特定環(huán)境下可分化為骨、軟骨、脂肪、肌肉、骨髓基質(zhì)、肌腱及韌帶等組織[4]。BMSCs具有定向遷移至損傷部位進(jìn)行增值、分化、并修復(fù)損傷組織的能力[5-7]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞取材容易，對機(jī)體損傷小，且體外培養(yǎng)簡單，細(xì)胞擴(kuò)增速度快，由于自體移植無明顯的免疫排斥反應(yīng)，也不涉及倫理道德問題，具有良好的臨床應(yīng)用前景，目前在組織工程、基因工程等研究中成為理想的種子細(xì)胞，在臨床疾病的治療過程中，對白血病、神經(jīng)損傷、癌癥的治療具有很高的醫(yī)療價值。

應(yīng)用外源性BMSCs治療后如何明確其療效是目前尚需解決的關(guān)鍵難題之一，SPIO是近年國外開始推廣應(yīng)用的一種標(biāo)記細(xì)胞的對比劑，它利用干細(xì)胞吞噬能力，通過簡單的體外培養(yǎng)，干細(xì)胞就會吞噬目該顆粒，對細(xì)胞進(jìn)行活體的示蹤研究，取得了很理想的成果[8]。本實(shí)驗(yàn)所用的SPIO是由Fe3O4和Fe2O3組成，是一種不需要轉(zhuǎn)染劑的SPIO。由于化學(xué)結(jié)構(gòu)的特殊，即使在較弱的外磁場中也可以產(chǎn)生巨大的磁性，而外磁場撤銷后磁性也迅速消失，即所謂超順磁性[9]。成為目前最常用的MRI監(jiān)測的負(fù)性對比劑，應(yīng)用于多種細(xì)胞的標(biāo)記，以及標(biāo)記后體內(nèi)移植的活體示蹤研究。但是對于細(xì)胞的毒副作用主要來自于細(xì)胞體內(nèi)鐵的含量，如何確定Fe濃度的安全有效范圍成為我們研究的重點(diǎn)，一般文獻(xiàn)中常用的SPIO標(biāo)記細(xì)胞的濃度，通常在10～50mg/L。但是有研究指出20 mg/L鐵已經(jīng)達(dá)到了標(biāo)記干細(xì)胞所需要濃度的最高限，在此濃度閾值孵育過夜，細(xì)胞標(biāo)記率超過97%。然而Fe的濃度達(dá)到50 mg/L，細(xì)胞的生物學(xué)特性、增殖能力、遷移能力就會受到不同程度的抑制。Ben等[10]研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)過多的游離的鐵能使細(xì)胞的氧化作用加強(qiáng)，產(chǎn)生過多的氧化產(chǎn)物和羥基自由基，細(xì)胞容易受到損傷，增殖活性降低，甚至細(xì)胞出現(xiàn)壞死的現(xiàn)象。這與本實(shí)驗(yàn)濃度25 mg/L組的臺盼藍(lán)活細(xì)胞計數(shù)及MTT比對照組明顯降低，這與高濃度Fe抑制干細(xì)胞的增殖，活性降低互相吻合。本實(shí)驗(yàn)的初步結(jié)果顯示濃度為15 mg/L的SPIO標(biāo)記后的BMSCs生長狀態(tài)與對照組無差異，能夠保持原有的細(xì)胞狀態(tài)，形態(tài)均勻，呈長狀，排列緊密，傳代融合時間與對照組一致，臺盼藍(lán)活細(xì)胞計數(shù)實(shí)驗(yàn)及MTT細(xì)胞增殖檢測都證明了標(biāo)記后的細(xì)胞仍具有良好的生物學(xué)活性和正常的增殖能力。I ttrich等[11]研究結(jié)果也證實(shí)低濃度的Fe不會對細(xì)胞生命產(chǎn)生影響。因此，SPIO濃度為15 mg/L可安全高效標(biāo)記BMSCs，為活體示蹤提供較好的技術(shù)方法，可用于對BMSCs在體內(nèi)遷移、分化相關(guān)研究的示蹤。

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