王俊紅 郭永紅 張 靜 徐 靜 謝 璇 楊廣笑 王全穎 王 楓

1.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，陜西西安 710004；2.第四軍醫(yī)大學(xué)營養(yǎng)與食品衛(wèi)生教研室，陜西西安 710032；3.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院感染科，陜西西安 710004；4.西安華廣生物工程有限公司，陜西西安 710025

Exendin-4是胰高血糖素樣肽-1（GLP-1）受體長效激動劑，具有與GLP-1相似的降血糖活性，目前已研發(fā)成為首個 “模仿腸降血糖素”治療2型糖尿病的藥物——Exenatide[1-2]。但是Exenatide需每日注射，對糖尿病患者的治療很不方便[3]，并且天然Exendin-4的提取成本高，難以滿足臨床應(yīng)用需要[4]，用基因工程方法生產(chǎn)前景廣闊。由于Exendin-4缺乏模板，本實驗利用重疊延伸PCR技術(shù)擴增出Exendin-4目的基因編碼區(qū)DNA片段，成功構(gòu)建了Exendin-4表達載體，為進一步利用腺相關(guān)病毒載體構(gòu)建表達Exendin-4及研究其在糖尿病治療過程中的分子作用機制奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒與菌株

克隆載體 pGEM-T-Easy質(zhì)粒（50 ng/μL）購自 Promega公司；大腸桿菌TOP10、E.coli DH5α菌株由西安華廣生物工程公司提供。

1.2 工具酶和主要試劑

限制性內(nèi)切酶NaeⅠ、BamHⅠ、EcoRⅠ及TaqDNA聚合酶、T4 DNA連接酶等試劑購自華美生物工程公司；質(zhì)粒小提試劑盒、PCR純化試劑盒、DNA回收試劑、Marker等均購自北京天根公司；引物合成及測序由上海生物工程有限公司完成；其他試劑及全部實驗設(shè)備均由西安華廣生物工程公司提供。

1.3 方法

1.3.1 重疊延伸PCR擴增Exendin-4 cDNA[3]根據(jù)美國專利檢索到Exendin-4氨基酸序列是39個氨基酸（sequence 1 from patent US 5424286 39aa），應(yīng)用 DNASIS 計算機軟件分析Exendin-4的開放閱讀框（ORF）和它的編碼子，截取39肽的編碼cDNA，設(shè)計正、負向引物/模板鏈，正向引物的5′端設(shè)計加入NaeⅠ酶切位點，負向引物的5′端加入終止子和BamHⅠ酶切位點。通過非對稱互補引物/模板（重疊）聚合酶鏈式反應(yīng)法獲得完整的Exendin-4，首先P1和P2互為引物和模板進行PCR擴增Exendin-4 cDNA核心區(qū)，以第1次PCR產(chǎn)物為模板，P3、P4為引物合成完整的Exendin-4，且分別在引物P3、P4中引入NaeⅠ和BamHⅠ酶切位點和終止子。引物序列見表1。PCR反應(yīng)體系：在 100 μL 反應(yīng)總體積中，加入 1 μL（0.1 mg/L）DNA模板，1 μL（50 μmol/L）上游引物，1 μL（50 μmol/L）下游引物，2 μL（10 mmol/L） dNTPs，10 μL 10×Taq DNA 聚合酶緩沖液，80 μL消毒去離子水，最后在體系表面加50 μL石蠟油；沸水中煮 5 min 后，立即冰浴 2 min，加 1 μL（1 U/μL）TaqDNA聚合酶入反應(yīng)體系。擴增條件如下：94℃預(yù)變性1 min，進入 94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，72℃延伸 5 min，32個循環(huán)；取擴增產(chǎn)物10 μL進行1%瓊脂糖電泳，觀察電泳結(jié)果。PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳法回收，正丁醇濃縮，酚∶氯仿抽提，無水乙醇沉淀；將沉淀溶于 20 μL TE（pH 8.0），4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 Exendin4 cDNA的T載體克隆和序列測定 將PCR產(chǎn)物連接到線性克隆載體pGEM Teasy中，轉(zhuǎn)化Top10受體菌，氨基芐青霉素篩選陽性克隆，堿裂解法小量提取質(zhì)粒，限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ酶切圖譜鑒定。連接反應(yīng)體系如下：①用T4 DNA連接酶連接質(zhì)粒pGEM-Teasy和PCR產(chǎn)物，10 μL 反應(yīng)體積中加入 1 μL（50 mg/L）載體 DNA，3 μL（0.5 g/L） PCR 產(chǎn)物，5 μL 2×T4 DNA 連接酶緩沖液，60℃水浴 5 min，冰浴 2 min，再加入 1 μL（3 U/μL） T4 DNA 連接酶，4℃水浴過夜。②用CaCl2法制備感受態(tài)大腸桿菌DH5α。③連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞，并將轉(zhuǎn)化菌在表面涂有X-gal和IPTG的瓊脂平板（Amp+）上進行培養(yǎng)。④挑選單個白色菌落，接種于10 mL LB培養(yǎng)液，37℃振搖培養(yǎng)16 h。⑤用堿裂解法提質(zhì)粒，限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ酶切分析法篩選陽性克隆，篩選到的重組子命名為pGEM-T/Exn-4。

1.3.3 核苷酸序列分析克隆基因序列 鑒定后的陽性重組質(zhì)粒DNA，用T7啟動子和SP6啟動子作為雙向測序引物，雙脫氧末端終止法測定克隆基因序列。

2 結(jié)果

2.1 目的基因Exendin-4 cDNA PCR結(jié)果

以互為模板的引物進行PCR，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物，所得產(chǎn)物與PCR Marker比較，在約136 bp處得到一條單一清晰的條帶，與目的片段預(yù)期大小一致。見圖1。

2.2 重組質(zhì)粒pGEM-T/Exn-4酶切鑒定

構(gòu)建的重組質(zhì)粒命名為pGEM-T/Exn-4，大小為3015+136 bp。經(jīng)EcoRⅠ酶切后，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果可見136 bp的目的片段，與理論值相符，說明Exendin-4已重組于pGEM-Teasy內(nèi)。見圖2。

2.3 Exendin-4的基因克隆測序結(jié)果

Exendin-4 cDNA測序結(jié)果與數(shù)據(jù)庫序列經(jīng)Blast比較完全一致。見圖3。

3 討論

GLP-1不僅具有降糖作用，還可以減輕體重、改善血脂，達到直接或間接的心血管保護效應(yīng)[6]，但GLP-1分泌后很快被二肽基肽酶Ⅳ（dipeptidyl peptidaseⅣ，DPP-Ⅳ）降解，體內(nèi)半衰期僅為2 min左右，很難應(yīng)用于臨床[7]。Exendin-4是從美國西南部大毒蜥唾液中分泌的天然腸促胰島素擬似物，具有與GLP-1相似的促進胰島素分泌功能，其生物活性比GLP-1高5000倍左右，且DPP-Ⅳ對Exendin-4酶解作用弱，因此，Exendin-4被認為是理想的治療2型糖尿病的新型藥物。人工合成的Exendin-4（Exenatide，商品名為Byetta）是首個獲準上市的腸促胰島素擬似物[8-9]。然而，天然Exendin-4的提取成本高，難以滿足臨床應(yīng)用需要。由于Exendin-4是一個只有39個氨基酸的短肽，體內(nèi)半衰期短，穩(wěn)定性差，因此，限制其在臨床應(yīng)用。用基因工程方法直接生產(chǎn)Exendin-4，表達水平低且容易降解，與載體蛋白融合表達也存在產(chǎn)量低、分離純化困難等問題。為解決這一難題，本實驗擬將Exendin-4 cDNA導(dǎo)入到分泌表達生物活性肽的專用載體，分泌表達目的蛋白Exendin-4，既可保證重組蛋白的活性又可避免原核表達高昂的生產(chǎn)成本。

表1 P1、P2、P3、P4 引物序列

重疊延伸PCR技術(shù)（gene splicing by overlap extension PCR，SOE-PCR）是采用具有互補末端的引物，使PCR產(chǎn)物形成了重疊鏈，從而在隨后的擴增反應(yīng)中通過重疊鏈的延伸，將不同來源的擴增片段重疊拼接起來[10]。重疊延伸PCR在基因的定點突變、融合基因的構(gòu)建、長片段基因的合成、基因敲除以及目的基因的擴增等方面有其廣泛而獨特的應(yīng)用。此技術(shù)利用PCR技術(shù)能夠在體外進行有效的基因重組，技術(shù)成功的關(guān)鍵是重疊互補引物的設(shè)計。本研究依據(jù)美國專利檢索到Exendin-4為39aa，序列如下：hgegtftsdl skqmeeeavr lfiewlkngg pssgappps。使用DNAsis軟件分析Exendin-4的ORF和它的編碼子，截取編碼39肽的cDNA，編輯完整的Exendin-4表達盒并使用DNAsis軟件分析。由于Exendin-4是從美國西南部大毒蜥唾液中分泌的物質(zhì)，沒有現(xiàn)成的模板行PCR擴增，因此本實驗利用重疊PCR技術(shù)擴增出Exendin-4目的基因，并成功構(gòu)建了Exendin-4重組載體，用T7啟動子和SP6啟動子脫氧末端終止法測定了克隆基因序列，DNA序列測定的結(jié)果與Gen-Bank提供的已知序列比較完全一致，為進一步構(gòu)建重組質(zhì)粒分泌表達Exendin-4蛋白奠定了實驗基礎(chǔ)。本文方法簡單可行，其結(jié)果將為利用基因工程的方法大量生產(chǎn)和純化高純度的Exendin-4提供良好基礎(chǔ)。

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