林宗漢 黃保華 黎 強(qiáng) 容向賓 龍飛攀 梁慶華 曾憲輝 鄭鐵牛

1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院骨科，廣西南寧 530011；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西南寧 530001

口服硫酸氨基葡萄糖治療膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis of the knee，簡(jiǎn)稱膝OA）在我國(guó)較為普遍，歐洲風(fēng)濕病協(xié)會(huì)和國(guó)際骨關(guān)節(jié)炎研究協(xié)會(huì)治療膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎亦推薦應(yīng)用硫酸氨基葡萄糖[1-2]，然而也有國(guó)外學(xué)者認(rèn)為“很少有證據(jù)表明，氨基葡萄糖能促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨功能恢復(fù)”[3]。為觀察其作用效果，本試驗(yàn)通過膝OA動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)，從細(xì)胞組織形態(tài)學(xué)探討硫酸氨基葡萄糖膠囊對(duì)兔膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡的影響，進(jìn)而初步評(píng)價(jià)硫酸氨基葡萄糖膠囊在膝OA防治中可能發(fā)揮的作用，為臨床治療提供參考和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

6月齡雌性新西蘭兔30只，體重2.5～3.0 kg，由廣西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供 [實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證SYXK（桂）2003-0001]。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

脫水機(jī)（ASP300S型，德國(guó) Leica公司）；包埋機(jī)（EG1160型，德國(guó) Leica公司）；光學(xué)顯微鏡（CX31型，日本OLYMPUS 公司）；切片機(jī)（RM2235 型，德國(guó) Leica公司）；漂片、烤片機(jī)（CS-Ⅲ型，孝感亞鵬公司）；圖文分析系統(tǒng)（HMIAS-2000型，武漢千屏醫(yī)學(xué)影像技術(shù)有限責(zé)任公司）。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)藥品

硫酸氨基葡萄糖膠囊，規(guī)格每粒0.314 g（浙江海正藥業(yè)股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20041316），TUNEL試劑盒（美國(guó)羅氏公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組

隨機(jī)分為硫酸氨基葡萄糖膠囊（簡(jiǎn)稱藥物組）、模型對(duì)照組（簡(jiǎn)稱對(duì)照組）、正常組共三組，每組10只動(dòng)物。

1.2.2 造模

藥物組、對(duì)照組共20只兔均使用1%戊巴比妥鈉3 mL/kg，兔耳緣靜脈注射，參照改良Huith法的造模方法，于無菌條件下切斷兔右膝內(nèi)側(cè)副韌帶、前后交叉韌帶及切除內(nèi)側(cè)半月板，縫合傷口，無菌敷料復(fù)蓋，術(shù)后連用3 d青霉素鈉（每天5萬U/kg）、鏈霉素（每天10萬U/kg）。術(shù)后1周始軀趕兔子每天行走2次，共30 min，連續(xù)4周。

1.2.3 給藥

根據(jù)Meeh-Rubner公式計(jì)算，藥物組給予硫酸氨基葡萄糖膠囊每只0.628 g/d，用生理鹽水配成30 mL液體灌喂，連用8周；對(duì)照組和正常組每日30 mL生理鹽水灌喂，連用8周。所有動(dòng)物單籠飼養(yǎng)，飼養(yǎng)至4周時(shí)藥物組、對(duì)照組各有1只兔子死亡，正常組有3只兔子死亡，予以剔除。造模后12周末分別處死所有動(dòng)物。

1.2.4 取材

在原料（g）∶水（mL）∶氨水（mL）為1.00∶2.10∶0.40、反應(yīng)溫度為80℃、反應(yīng)時(shí)間為60min、攪拌速度為100r/min、自然冷卻6h的條件下，考察機(jī)械球磨對(duì)直收率的影響，結(jié)果如表4所示，并進(jìn)行了相關(guān)分析。

所有動(dòng)物于造模后12周末取材。耳緣靜脈空氣栓塞處死，解剖右膝關(guān)節(jié)，肉眼觀察關(guān)節(jié)軟骨組織大體變化，后使用咬骨鉗、手術(shù)刀取內(nèi)側(cè)脛骨平臺(tái)軟骨組織放入4%多聚甲醛中備檢。

1.2.5 指標(biāo)檢測(cè)

1.2.5.1 HE染色 右膝內(nèi)側(cè)脛骨平臺(tái)4%多聚甲醛固定，脫鈣，脫水，石蠟包埋，連續(xù)切片（厚度 3 μm），蘇木精-伊紅染色，封片，光鏡下觀察軟骨形態(tài)變化。

1.2.5.2 原位末端標(biāo)記法檢測(cè)軟骨細(xì)胞凋亡率 切片常規(guī)脫臘至水，用蛋白酶K室溫孵育30 min，PBS洗2次，滴加50 μL的TUNEL反應(yīng)混合液，在濕盒中37℃孵育60 min（為防止蒸發(fā)和保證TUNEL反應(yīng)混合物均勻分布，在孵育過程中加蓋蓋玻片），PBS沖洗3次。擦干樣品周圍水分，加入50 μL轉(zhuǎn)化劑 POD，在濕盒中 37℃孵育30 min（為防止蒸發(fā)和保證轉(zhuǎn)化劑POD（辣根過氧化物酶）均勻分布，在孵育過程中加蓋玻片）。PBS沖洗3次，加入100 μL DAB底物溶液，室溫孵育10 min，PBS沖洗3次，封片。在光學(xué)顯微鏡下觀察，以細(xì)胞核中有棕褐色顆粒者為陽性細(xì)胞（即凋亡細(xì)胞）。每個(gè)標(biāo)本選擇細(xì)胞分布較均勻的高倍視野10張片計(jì)數(shù)，分別計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞；軟骨細(xì)胞凋亡率（%）=陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 13.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大體觀察

2.1.1 藥物組

關(guān)節(jié)面光滑，軟骨透明，有光澤，未見明顯缺損及新生物。切面見軟骨厚度正?；蛏栽龊瘛?/p>

關(guān)節(jié)面粗糙，凹凸不平，軟骨面顏色灰黃，無正常透明度及光澤，可見明顯缺損及骨贅形成。切面見軟骨變薄明顯。

2.1.2 正常組

關(guān)節(jié)軟骨表面光滑完整，呈乳白色或淡藍(lán)色，半透明狀。

2.2 組織病理學(xué)觀察

2.2.1 藥物組

大部分動(dòng)物軟骨表面光滑平整，局部可見小裂隙，四層結(jié)構(gòu)基本清晰。部分動(dòng)物軟骨層增厚，表、中層細(xì)胞增多，排列稍紊亂。潮線清晰完整（圖1a）。

2.2.2 對(duì)照組

軟骨表面不光滑，可見深達(dá)輻射層的糜爛及缺損，周圍軟骨見簇狀增生，局灶骨贅形成。四層結(jié)構(gòu)紊亂。軟骨層厚度不均，大部分軟骨層明顯變薄，軟骨細(xì)胞減少。潮線扭曲紊亂（圖1b）。

2.2.3 正常組

關(guān)節(jié)軟骨各層次明確，其中表層軟骨細(xì)胞呈類圓形，排列近似水平狀，分布較均勻；中間層（移行層與輻射層）軟骨細(xì)胞為圓形，呈散在、無序排列，有聚集現(xiàn)象；鈣化層軟骨細(xì)胞呈柱狀排列，細(xì)胞較少，未見軟骨細(xì)胞簇集，潮線完整（圖1c）。

2.3 兔軟骨組織細(xì)胞凋亡情況

動(dòng)物膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡見圖2，凋亡率見表1。結(jié)果顯示，藥物組細(xì)胞凋亡率比正常組高，比對(duì)照組低，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

表1 兔子膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡率（%，±s）

注：與對(duì)照組比較，△P＜0.01；與正常組比較，◇P＜0.01

組別 只數(shù) 凋亡率藥物組對(duì)照組正常組997 16.61±2.14△◇30.50±4.72 4.67±1.85△

3 討論

目前對(duì)膝OA的病因尚未完全明了，大多數(shù)OA的發(fā)病缺乏已知病因，但一般認(rèn)為該病的始發(fā)部位在軟骨[4]。軟骨組織的損傷啟動(dòng)并影響著膝OA發(fā)生、發(fā)展的整個(gè)病程。有學(xué)者[5-6]認(rèn)為骨關(guān)節(jié)病炎發(fā)病與滑膜、軟骨細(xì)胞的凋亡有關(guān)。細(xì)胞凋亡即程序性細(xì)胞死亡，通常認(rèn)為導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的程序在機(jī)體內(nèi)、外因素作用下被啟動(dòng)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生。正常軟骨細(xì)胞的凋亡參與細(xì)胞數(shù)量的調(diào)節(jié)，在軟骨發(fā)育和關(guān)節(jié)區(qū)的穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要的作用，但過度凋亡則是病理的和有害的。已有研究發(fā)現(xiàn)軟骨細(xì)胞的過度凋亡與軟骨組織損傷有密切關(guān)系[7-9]。本實(shí)驗(yàn)通過右膝內(nèi)側(cè)副韌帶、前后交叉韌帶及切除內(nèi)側(cè)半月板造成膝關(guān)節(jié)內(nèi)環(huán)境損傷，建立并觀察軟骨細(xì)胞凋亡模型。

硫酸氨基葡萄糖治療膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎一直存在爭(zhēng)議，歐洲風(fēng)濕病協(xié)會(huì)和國(guó)際骨關(guān)節(jié)炎研究協(xié)會(huì)治療膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎推薦應(yīng)用硫酸氨基葡萄糖[1-2]，然在2009年一項(xiàng)綜述認(rèn)為“很少有證據(jù)表明，氨基葡萄糖能促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨功能恢復(fù)”[3]。一些學(xué)者做了相關(guān)的基礎(chǔ)研究，認(rèn)定硫酸氨基葡萄糖有一定的療效，并且在歐洲得到肯定。硫酸氨基葡萄糖作用機(jī)制研究如下：①硫酸氨基葡萄糖能控制軟骨葡萄糖胺聚糖和蛋白多糖合成的速度，從而促進(jìn)蛋白多糖的生物合成，保護(hù)與修補(bǔ)軟骨基質(zhì)和恢復(fù)受損的軟骨細(xì)胞；②硫酸氨基葡萄糖可以調(diào)節(jié)膠原酶[10]和磷脂酶A2的活性，減少損傷細(xì)胞的內(nèi)毒性因子釋放，還可以通過減少降解、促進(jìn)合成而恢復(fù)葡萄糖胺聚糖的代謝失衡；③硫酸氨基葡萄糖能抑制促炎癥細(xì)胞因子表達(dá)，減少關(guān)節(jié)的破壞和炎性反應(yīng)。硫酸氨基葡萄糖作用是否對(duì)膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡產(chǎn)生影響，目前尚缺乏類似的基礎(chǔ)研究。

本組實(shí)驗(yàn)的對(duì)照組在宏觀的解剖形態(tài)和組織病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)膝關(guān)節(jié)軟骨受損嚴(yán)重，同時(shí)從過微觀顯微鏡下觀測(cè)軟骨細(xì)胞軟骨細(xì)胞凋亡率達(dá)到（30.50±4.72）%，光鏡顯示軟骨組織損傷明顯。而藥物組細(xì)胞凋亡率較對(duì)照組明顯要低，兩者差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01），光鏡顯示軟骨組織損傷較輕。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)硫酸氨基葡萄糖與膝關(guān)節(jié)軟骨凋亡有關(guān)，可減輕兔膝關(guān)節(jié)軟骨組織的損傷及軟骨細(xì)胞的凋亡，其具體的作用機(jī)制尚需要進(jìn)一步深入研究。結(jié)合目前的臨床使用與一些基礎(chǔ)研究文獻(xiàn)[11-13]提示，硫酸氨基葡萄糖治療膝OA效果確切，值得臨床醫(yī)生重視。

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