李曉明，陶英群，朱廷準(zhǔn)，梁國標(biāo)

半乳糖凝集素-3(Galectin-3，Gal-3)具有識別并結(jié)合β-半乳糖苷的特性，因?yàn)閰⑴c調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的粘附、增殖、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)移及血管生成等過程，與腫瘤的惡性程度相關(guān)［1］，也被稱為腫瘤相關(guān)蛋白［2］。在不同的腫瘤組織中，Gal-3呈現(xiàn)不同的上調(diào)表達(dá)，目前，在諸多的癌癥如甲狀腺腫瘤和乳腺癌、胃腸癌、卵巢癌、淋巴瘤、肺癌及黑色素瘤的患者血清中，已經(jīng)成為診斷和判斷預(yù)后的生物指標(biāo)［3］。已有研究表明，用免疫組化染色和定量染色評分的方法發(fā)現(xiàn)，Gal-3在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(Ⅳ級膠質(zhì)瘤)組織中大量表達(dá)［4］，而在低級(Ⅱ級)膠質(zhì)瘤組織中基本不表達(dá)，在間變型(Ⅲ級)膠質(zhì)瘤組織中處于中間表達(dá)，正常腦組織和良性腫瘤中不表達(dá)Gal-3蛋白，說明Gal-3的表達(dá)與膠質(zhì)瘤的惡性程度成正相關(guān)性［5］。近年來，Gal-3因已成為抗癌藥物的靶點(diǎn)而備受關(guān)注，已有多種Gal-3抑制劑開發(fā)出來作為抗癌藥物的先導(dǎo)分子［6］。因此，研究格列衛(wèi)在腫瘤細(xì)胞中的作用機(jī)制和與細(xì)胞凋亡的關(guān)系有重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑 格列衛(wèi)(Gleevec，酪氨酸激酶抑制劑)為諾華制藥有限公司產(chǎn)品;STS(Stauroporine，星形孢菌素-凋亡誘導(dǎo)劑)和溶酶體抑制劑ConA、核染料 Hochest33342、細(xì)胞分離液 percoll均為Sigma公司產(chǎn)品;膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株U87由本實(shí)驗(yàn)室凍存;DMEM培養(yǎng)基為invitrogen公司產(chǎn)品;胎牛血清購自四季青公司;Gal-3鼠單克隆抗體和Lamp2兔多抗均為Santa Cruz Biotechnology產(chǎn)品，β-actin鼠單克隆抗體為Sigma公司產(chǎn)品;山羊抗鼠FITC熒光二抗和山羊抗兔TRITC熒光二抗為中山公司抗體。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) U87細(xì)胞株用含10%胎牛血清的 DMEM培養(yǎng)基(含100 IU/mL青霉素，100 mg/mL鏈霉素)培養(yǎng)，置 37 ℃、5%CO2、濕度95%的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)并傳代。

1.2.2 細(xì)胞免疫染色 先用3.7%多聚甲醛溶液固定細(xì)胞，室溫孵育15 min，用PBS洗3次，每次5 min。0.1% 的 TritonX-100，室溫孵育 5 min后PBS洗3次;然后用1%山羊血清封閉1 h，PBS洗3次;1%山羊血清封閉液配制的一抗孵育1 h后用PBS洗3次;二抗孵育1 h后PBS洗3次;最后用1 μg/mL Hochest33342進(jìn)行細(xì)胞核染色，室溫孵育30 min后用PBS洗3次，置激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.2.3 溶酶體提取 所有操作都在4℃進(jìn)行。用 STE緩沖液［0.25 M 蔗糖，20 mM Tris/HCl(pH 7.2)，5 mM MgCl2］與細(xì)胞孵育 20 min，在顯微鏡下觀察細(xì)胞膨脹率達(dá)90%以上，用Dounce勻漿器將收集的細(xì)胞進(jìn)行勻漿，勻漿后在鏡下觀察細(xì)胞90%以上破碎時(shí)，在800 g離心10 min，此時(shí)收集的上清稱為 PNS(Postnuclear supernatant)。將PNS小心注入裝有23%(v/v)percoll離心管中，高速離心，59 000 g離心27 min，可得到分離的溶酶體。

1.2.4 Western blot檢測蛋白量 將“1.2.3”步驟中分離得到的溶酶體或者各處理組細(xì)胞在不同時(shí)間點(diǎn)收取細(xì)胞后，分別加入單去污細(xì)胞裂解液(50 mmol/L Tris-Cl，150 mmol/L NaCl，0.02% 疊氮鈉，1%NP40，復(fù)合蛋白酶抑制劑)，裂解物加入5×SDS上樣緩沖液在沸水中煮沸5 min，裂解上清經(jīng)10%SDS-PAGE凝膠電泳，PVDF膜濕轉(zhuǎn)300 mA 60 min，分別與抗 Gal-3抗體和抗 β-actin抗體、抗Lamp2蛋白進(jìn)行孵育，再與辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗進(jìn)行孵育，最后用化學(xué)發(fā)光試劑顯影，凝膠系統(tǒng)成像，Gal-Pro analyzer軟件分析條帶灰度值，以 Gal-3/β-actin和 Gal-3/Lamp2蛋白表達(dá)的條帶灰度比值作為Gal-3蛋白的相對表達(dá)量。

1.2.5 Sub G1方法檢測細(xì)胞凋亡率 將各組細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化后，用含血清的培養(yǎng)基終止反應(yīng)，500 g離心3 min，再用PBS洗細(xì)胞，再次離心沉淀細(xì)胞。逐滴加入2 mL的70%乙醇(70%乙醇溶于PBS中)，在冰上孵育30 min，重復(fù)用PBS洗2次后離心沉淀，加2 mL P-C Buffer(0.2 M NaH2PO4192 mL;0.2 M檸檬酸鈉8 mL)，室溫孵育30 min。用PBS洗2次后離心沉淀，加入0.3 mL RNase溶液(20 μg/mL，PBS 溶解)，孵育 30 min 后加 3 μL pI溶液(10 mg/mL，PBS溶解)，孵育5 min。用流式細(xì)胞儀檢測，分析凋亡細(xì)胞比率。

2 結(jié)果

2.1 格列衛(wèi)誘導(dǎo)Gal-3進(jìn)入溶酶體 用5 μM格列衛(wèi)處理 U87細(xì)胞 18 h，對照組 U87細(xì)胞用0.1%DMSO(0.1%DMSO是溶解格列衛(wèi)時(shí)的助溶劑)處理相同時(shí)間，一抗分別用抗Gal-3抗體、抗Lamp2抗體(溶酶體膜蛋白標(biāo)記物)，熒光二抗分別用FITC標(biāo)記Gal-3、TRITC標(biāo)記Lamp-2進(jìn)行細(xì)胞免疫染色，用Hochest33342標(biāo)記細(xì)胞核，如圖1所示，未經(jīng)處理的U87細(xì)胞中，Gal-3主要分布在細(xì)胞核，細(xì)胞質(zhì)中也有少量分布，Lamp-2呈現(xiàn)點(diǎn)狀分布;用格列衛(wèi)處理后，Gal-3發(fā)生點(diǎn)狀聚集并與溶酶體蛋白Lamp-2呈共定位(Merge圖中的黃色區(qū)域)，說明Gal-3聚集到了溶酶體。

圖1 格列衛(wèi)處理U87細(xì)胞株免疫染色結(jié)果

為了進(jìn)一步證明格列衛(wèi)能夠使Gal-3聚集到溶酶體，將U87細(xì)胞分成2組，一組使用5 μM 格列衛(wèi)處理18 h，另一組用0.1%DMSO處理，然后對兩組細(xì)胞按照溶酶體的提取方法提取溶酶體并進(jìn)行Western blot檢測，如圖2所示。以Lamp-2表達(dá)量為內(nèi)參，在沒有細(xì)胞質(zhì)污染的情況下，對兩組細(xì)胞的溶酶體Gal-3/Lamp-2蛋白表達(dá)條帶灰度值的比值進(jìn)行比較，格列衛(wèi)處理組細(xì)胞的溶酶體中Gal-3的量是非處理組的6.91倍，說明格列衛(wèi)誘導(dǎo)Gal-3聚集到溶酶體中。

圖2 格列衛(wèi)處理后U87細(xì)胞株溶酶體中Gal-3量的變化

2.2 格列衛(wèi)使U87細(xì)胞中Gal-3蛋白量下降 以β-actin作為內(nèi)參，對各不同處理組 Gal-3/β-actin蛋白表達(dá)條帶灰度比值進(jìn)行比較，如圖3所示。用5 μM 格列衛(wèi)處理U87細(xì)胞18 h后，檢測細(xì)胞內(nèi)源Gal-3的蛋白量，發(fā)現(xiàn)與未處理組細(xì)胞相比，Gal-3的蛋白量降低至48.73%，單獨(dú)使用0.5 μM凋亡誘導(dǎo)劑STS處理時(shí)，Gal-3的蛋白量沒有顯著變化;當(dāng)5 μM 格列衛(wèi)和0.5 μM STS同時(shí)處理細(xì)胞時(shí)，Gal-3蛋白量降低至17.88%，說明格列衛(wèi)和STS同時(shí)使用，在促Gal-3蛋白降解方面起到協(xié)同的作用;當(dāng)在上述的各組處理中加入溶酶體特異性抑制劑ConA(10 μM)后，格列衛(wèi)處理組與未處理組細(xì)胞中Gal-3的蛋白量沒有顯著差異，說明Gal-3通過溶酶體途徑發(fā)生了蛋白的降解。

圖3 格列衛(wèi)對Gal-3蛋白量的影響

2.3 格列衛(wèi)促進(jìn)U87細(xì)胞凋亡 將U87細(xì)胞分成格列衛(wèi)(5 μM)處理和不處理2組，處理18 h后，將兩組細(xì)胞再分成用STS(0.5 μM)處理和不處理2組，處理12 h后，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞凋亡分析(圖4)，結(jié)果顯示，未處理組U87細(xì)胞的凋亡率為0.00% ±0.011%，格列衛(wèi)處理組細(xì)胞的凋亡率為8.94% ±0.034%，STS處理組的細(xì)胞凋亡率為28.12% ±0.032%，而格列衛(wèi)和STS雙處理組的細(xì)胞凋亡率為51.29%±0.098%。上述結(jié)果說明，格列衛(wèi)能夠誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡，并增加腫瘤細(xì)胞對凋亡誘導(dǎo)劑的敏感性，當(dāng)與低劑量的凋亡誘導(dǎo)劑STS共同使用時(shí)，會出現(xiàn)協(xié)同誘導(dǎo)凋亡的效果。

圖4 不同處理的U87細(xì)胞株凋亡檢測

3 討論

格列衛(wèi)作為全球首個(gè)獲得FDA批準(zhǔn)上市的分子靶向抗癌藥物，目前作為治療慢性髓樣白血病一線藥物和不能手術(shù)切除的胃腸道間質(zhì)腫瘤［7］。這種激酶抑制劑在其他實(shí)體腫瘤的應(yīng)用方面也開展了很多的相關(guān)研究，如動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，格列衛(wèi)能夠有效抑制裸鼠的小細(xì)胞肺癌的生長，也能夠抑制裸鼠顱內(nèi)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的生長［8］。但是格列衛(wèi)抑制實(shí)體腫瘤的作用機(jī)制尚未闡明。

本研究發(fā)現(xiàn)，格列衛(wèi)處理膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U87細(xì)胞后，使Gal-3聚集到溶酶體中，并且Gal-3的蛋白量顯著降低，用溶酶體特異性抑制劑ConA能夠阻止Gal-3蛋白量的降低，說明Gal-3是通過溶酶體途徑發(fā)生了降解;檢測細(xì)胞凋亡率發(fā)現(xiàn)，格列衛(wèi)有誘導(dǎo)U87細(xì)胞株凋亡的作用，同時(shí)格列衛(wèi)的使用能夠使腫瘤細(xì)胞對凋亡誘導(dǎo)劑STS作用的敏感性增加，說明格列衛(wèi)與凋亡誘導(dǎo)劑之間存在協(xié)同誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。

格列衛(wèi)作為酪氨酸激酶抑制劑能夠促使癌蛋白Gal-3發(fā)生溶酶體降解，說明Gal-3是受酪氨酸激酶調(diào)控的蛋白，激酶受到阻斷劑的抑制后，這種癌蛋白便進(jìn)入溶酶體發(fā)生蛋白的降解，使得細(xì)胞更容易受凋亡誘導(dǎo)劑的誘導(dǎo)而發(fā)生細(xì)胞凋亡，一方面證明了Gal-3在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中起著抗凋亡的作用，另一方面證明Gal-3可以作為該種腫瘤的治療靶標(biāo)，這對于以Gal-3為靶標(biāo)治療該種腫瘤和研究Gal-3在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的作用機(jī)理研究提供了重要的線索。

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