顧海龍, 林志華, 沈偉良, 陳彩芳

(1. 上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院, 上海 201306; 2. 浙江萬里學(xué)院 生物與環(huán)境學(xué)院, 浙江 寧波 315100;3. 寧波市海洋與漁業(yè)研究院, 浙江 寧波 315100)

灘涂貝類養(yǎng)殖在我國有著悠久的歷史, 已成為我國海水養(yǎng)殖業(yè)的一個生長點。我國海岸線漫長, 沿海灘涂面積約 200萬 ha, 發(fā)展灘涂貝類養(yǎng)殖空間十分廣闊。但近年來, 由于爛采酷捕, 再加上環(huán)境污染,致使灘涂貝類天然資源日趨衰竭, 因此, 需大力開展灘涂貝類的人工增養(yǎng)殖。而目前, 國內(nèi)外關(guān)于灘涂貝類繁殖生物學(xué)方面的研究資料很少[1-3]。

在雙殼貝類的卵子發(fā)生中, 除卵原細(xì)胞期外,其他各期細(xì)胞均屬初級卵母細(xì)胞階段。此階段為卵母細(xì)胞的生長時期, 在此時期, 卵子的各個不同的發(fā)育階段, 主要的區(qū)分標(biāo)志是卵黃顆粒的形成[4]。然而至今, 對初級卵母細(xì)胞的發(fā)育過程分期尚未形成統(tǒng)一定論, 但基本大同小異, 大致可分為卵黃合成前期、卵黃合成期及卵黃合成后期[1,5-7]。

泥蚶(Tegillarca granosa)是我國重要的傳統(tǒng)經(jīng)濟貝類之一, 是東南沿海地區(qū)的主要灘涂增養(yǎng)殖對象。近年來對于泥蚶的研究報道較多, 但主要集中在遺傳育種[8-10]、免疫學(xué)[11-13]和生態(tài)毒理學(xué)[14-16]等方面,而與繁殖相關(guān)的生殖細(xì)胞生物學(xué)研究僅見泥蚶精子超微結(jié)構(gòu)的報道[17]。本文利用透射電鏡對泥蚶初級卵母細(xì)胞發(fā)育及其卵黃發(fā)生過程進行了觀察研究,以期進一步豐富泥蚶的繁殖發(fā)育生物學(xué)基礎(chǔ)理論。

1 材料與方法

1.1 材料

泥蚶采自浙江省寧波市甬盛水產(chǎn)種業(yè)有限公司,分別于2011年6月、7月及8月采樣3次, 此時泥蚶正處于繁殖期, 每次取 10只泥蚶, 解剖得到其卵巢。將卵巢一分為二, 一部分用于做組織切片觀察,進行性腺各發(fā)育期的鑒定; 另一部分用于進行電鏡觀察。

1.2 方法

利用組織切片觀察, 獲得性腺發(fā)育期處于間期、增殖期、生長期和成熟期的卵巢樣品, 將其相應(yīng)的另一部分卵巢組織用 2.5%戊二醛固定后, 用 1%鋨酸進行二次固定, 乙醇系列脫水, Epon812環(huán)氧樹脂包埋, RMC POWER-TOME XL 超薄切片機切片, 醋酸鈾檸檬酸鉛雙重染色, 日立 H-7650型透射電鏡觀察、拍照。

2 結(jié)果

2.1 卵母細(xì)胞發(fā)育分期

根據(jù)透射電鏡觀察到的各時期卵巢樣品中卵母細(xì)胞內(nèi)各細(xì)胞器的變化和卵黃粒的形成與否, 將泥蚶卵母細(xì)胞的發(fā)育過程分成三個時期, 分別為卵黃合成前期、卵黃合成期、卵黃合成后期。

2.1.1 卵黃合成前期

此期卵母細(xì)胞形狀不規(guī)則, 胞體表面呈現(xiàn)大量的微絨毛(圖1-1,MV)。胞內(nèi)細(xì)胞器較少, 細(xì)胞核多呈球形或橢球形(圖 1-3,N), 一部分卵母細(xì)胞的細(xì)胞核形狀開始發(fā)生變化, 細(xì)胞核形成“偽足”狀外凸(圖1-2,箭頭示)。染色質(zhì)聚集成塊分布于核基質(zhì)中(圖1-3)。細(xì)胞中線粒體較多, 呈圓形或橢圓形(圖1-3,M)。粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)不發(fā)達(dá), 其上布滿核糖體(圖1-4,RER), 周圍分布少量的囊泡。高爾基復(fù)合體很少且不發(fā)達(dá)(圖 1-4,G)。胞內(nèi)溶酶體豐富, 并存在少量電子密度較高的卵黃物質(zhì)(圖1-4,箭頭示)。質(zhì)膜向內(nèi)凹陷(圖 1-5,箭頭示)。

2.1.2 卵黃合成期

泥蚶卵黃合成時期, 卵母細(xì)胞大量合成卵黃物質(zhì)。細(xì)胞體積變大, 仍為不規(guī)則形狀。細(xì)胞質(zhì)膜內(nèi)側(cè)有大量小泡(圖1-6,MP)。細(xì)胞核發(fā)生變化較大, 核膜向內(nèi)凹陷, 內(nèi)陷處的電子密度較高(圖 1-5,雙箭頭示)。細(xì)胞邊緣出現(xiàn)少量脂滴(圖1-6,L)。細(xì)胞中出現(xiàn)很多卵黃粒(圖 1-7,Y)。線粒體數(shù)量明顯增加, 一部分線粒體開始膨大、泡化, 內(nèi)部嵴消失(圖 1-8,箭頭示), 另一部分則保持原狀(圖1-8,M)。粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)非常發(fā)達(dá), 片層很多, 可分為片層狀(圖 1-8,RER)和重疊的環(huán)狀(圖1-9,RER)兩種形態(tài)。高爾基復(fù)合體增多,其兩端膨大、分離、融合形成大量的高爾基體囊泡分布于胞質(zhì)中(圖1-10,GV)。

2.1.3 卵黃合成后期

卵黃形成后期, 卵母細(xì)胞發(fā)育成熟, 細(xì)胞體積達(dá)到最大。細(xì)胞內(nèi)線粒體數(shù)量較多, 內(nèi)部嵴不甚發(fā)達(dá),電子密度較低(圖1-11, M)。粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)不發(fā)達(dá), 多為單層(圖版 1-11, RER)。高爾基復(fù)合體不發(fā)達(dá)(圖1-11,G)。形態(tài)各異的卵黃粒分布于整個卵母細(xì)胞(圖1-11,Y)。

2.2 卵黃粒的來源

電鏡觀察發(fā)現(xiàn), 泥蚶卵母細(xì)胞發(fā)育過程中, 線粒體、高爾基體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、微吞飲泡等都參與了卵黃的發(fā)生和卵黃粒的形成。

2.2.1 線粒體

卵黃發(fā)生過程中, 散布于細(xì)胞質(zhì)中的一部分線粒體外膜皺褶, 體積膨脹、泡化, 內(nèi)部只殘余少量短嵴, 隨后高電子密度的卵黃物質(zhì)沉積于其中并逐漸充滿整個線粒體, 形成卵黃粒(圖1-12,MY)。線粒體演變成的卵黃粒初期仍具有線粒體的雙層膜特征,外膜呈波浪狀。

2.2.2 高爾基復(fù)合體

泥蚶卵黃發(fā)生時, 高爾基復(fù)合體數(shù)量增多, 其扁平囊末端膨大、分離形成小泡, 小泡隨即互相融合形成高爾基體囊泡。胞質(zhì)內(nèi)的脂類和蛋白質(zhì)在高爾基體囊泡內(nèi)沉積、濃縮并最終演變?yōu)槁腰S粒(圖1-10,GVY)。

2.2.3 粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)

卵黃發(fā)生期間, 粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)很發(fā)達(dá), 一部分仍保持片層狀結(jié)構(gòu), 表面布滿核糖體, 另一部分則呈多層重疊的環(huán)狀結(jié)構(gòu)。片層狀的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)兩端膨大形成小囊泡, 小囊泡互相融合形成大泡, 卵黃物質(zhì)在其內(nèi)沉積形成卵黃粒(圖1-13,Y); 環(huán)狀的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)則包繞在線粒體、脂滴等物質(zhì)周圍形成卵黃粒(圖 1-14,箭頭示)。

2.2.4 微吞飲泡

微吞飲泡也是卵黃粒的來源之一。卵黃發(fā)生時,質(zhì)膜內(nèi)陷, 形成吞飲泡, 隨著卵黃物質(zhì)在其內(nèi)沉積,吞飲泡逐漸成為電子密度較高的卵黃粒(圖 1-6,MPY)。

3 討論

3.1 泥蚶卵黃發(fā)生的特點

泥蚶初級卵母細(xì)胞卵黃發(fā)生期間, 大多數(shù)細(xì)胞器的數(shù)量和形態(tài)都發(fā)生了明顯的變化。卵黃合成前期, 細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器數(shù)量較少, 粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體等細(xì)胞器均不甚發(fā)達(dá)。隨著卵黃合成的進行, 線粒體等細(xì)胞器明顯增多, 質(zhì)膜內(nèi)部出現(xiàn)大量的微吞飲泡,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基復(fù)合體等片層增加, 它們都以各自的形式參與著卵黃粒的形成。到卵黃形成后期, 細(xì)胞器數(shù)量急劇減少, 大量的卵黃粒充滿整個細(xì)胞, 卵母細(xì)胞發(fā)育成熟。由此可見, 本研究發(fā)現(xiàn)泥蚶卵黃發(fā)生期間細(xì)胞內(nèi)部的一系列變化與其他軟體動物的研究結(jié)果基本一致[1-3,5-6,18-25]。

線粒體直接轉(zhuǎn)變?yōu)槁腰S粒的現(xiàn)象自從被 Favard等在扁卷螺(Planor bis)中發(fā)現(xiàn)[22]后, 已在文蛤(Meretrix meretrix)[1]、縊蟶(Sinonovacula constricta)[2]、太平洋牡蠣(Crassostrea giga)[5]等多個物種中得到論證。泥蚶卵黃發(fā)生過程中也存在這一現(xiàn)象, 上官步敏等將線粒體分為Ⅰ型和Ⅱ型兩種[2], 本實驗中觀察到泥蚶卵母細(xì)胞內(nèi)參與卵黃顆粒形成的線粒體多為球狀或橢球狀的Ⅱ型(圖1-3,M)。

圖1 卵母細(xì)胞發(fā)育的組織學(xué)和超微結(jié)構(gòu)觀察Fig. 1 Histology and ultrastructure observation of oocyte development

眾學(xué)者對粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)參與卵黃粒形成的方式所持觀點較多, 概括起來可分為兩種: 一種是呈環(huán)狀包繞在線粒體、脂滴、小囊泡或卵黃顆粒周圍形成卵黃粒; 另一種是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)兩端膨大形成小囊泡, 小囊泡互相融合形成大泡, 卵黃物質(zhì)在大泡內(nèi)沉積形成卵黃粒。各物種的觀察結(jié)果不盡相同: 文蛤[1]、縊蟶[2]、青蛤[3]、太平洋牡蠣[5]、櫛孔扇貝[23]中兩種形式均有; 貽貝[18,24]、僧帽牡蠣[21]、皺紋盤鮑[25]中只存在第一種形式; 墨西哥灣扇貝[6]只存在第二種形式。在泥蚶中的觀察結(jié)果與大多數(shù)貝類相同, 粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)以兩種形式參與卵黃粒的形成。

高爾基體在卵黃形成的過程中也較活躍, 與其他物種一樣, 泥蚶卵母細(xì)胞中的高爾基體主要以分離成大量的高爾基液泡的形式來形成卵黃粒。高爾基體是對細(xì)胞分泌物進行最后加工和包裝的細(xì)胞器,這可能是高爾基體在卵黃合成前期數(shù)量很少, 而后期相對較多的主要原因。

與其他參與卵黃粒形成的細(xì)胞器相比, 線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的作用更為明顯。卵黃發(fā)生期間, 線粒體的數(shù)目急劇增加, 且大部分的線粒體內(nèi)部嵴逐漸溶解消失, 形成卵黃粒; 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)高度發(fā)達(dá), 到卵黃合成后期, 細(xì)胞內(nèi)仍可見相當(dāng)數(shù)量的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)潴泡。因此, 我們認(rèn)為, 線粒體和粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是泥蚶卵黃發(fā)生過程中形成卵黃粒的主要胞器。

3.2 卵黃發(fā)生的物質(zhì)來源

眾所周知, 卵黃發(fā)生的物質(zhì)來源分為內(nèi)源性和外源性兩種[26]。卵黃發(fā)生期間卵母細(xì)胞內(nèi)的卵黃物質(zhì)非常豐富, 這顯然是內(nèi)源性和外源性兩種途徑共同作用獲得的。

內(nèi)源性卵黃發(fā)生主要由線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及其他細(xì)胞器完成。外源性卵黃發(fā)生則依靠卵母細(xì)胞表面的受體介導(dǎo)內(nèi)吞作用[27], 將卵母細(xì)胞外的營養(yǎng)物質(zhì)運送至卵母細(xì)胞內(nèi), 為卵黃的發(fā)生提供原料。隨著發(fā)育的進行, 卵母細(xì)胞逐漸脫離濾泡細(xì)胞, 僅通過橋粒結(jié)構(gòu)與濾泡細(xì)胞相連[28]。本研究中卵母細(xì)胞表面產(chǎn)生大量的微絨毛, 電鏡下的微絨毛橫截面管腔清晰可見(圖 1), 且微絨毛伸入濾泡細(xì)胞內(nèi), 其基部膨大, 周圍聚集大量的糖原顆粒(圖 1-1,gl), 通過微絨毛管腔以吞飲泡的形式進入卵母細(xì)胞。濾泡細(xì)胞雖然通過這種方式參與了卵黃的發(fā)生, 但它數(shù)量少、體積小并且卵黃發(fā)生期間的自身變化不大, 這都決定了它作為外源性原料的局限性。泥蚶與其他雙殼貝類一樣[1,5,29], 營養(yǎng)物質(zhì)主要貯存于消化腺, 生殖期間, 性腺緊緊包繞在消化腺的周圍, 而腸道組織穿過性腺, 且解剖泥蚶時發(fā)現(xiàn), 性腺越好的泥蚶消化腺相對越小。所以, 作者認(rèn)為泥蚶卵黃發(fā)生時期外源性營養(yǎng)物質(zhì)主要來源于消化腺。

[1]應(yīng)雪萍. 文蛤卵母細(xì)胞卵黃發(fā)生的超微結(jié)構(gòu)[J]. 中國水產(chǎn)科學(xué), 2002, 9(2): 125-128.

[2]上官步敏, 劉正琮. 縊蟶卵母細(xì)胞卵黃發(fā)生過程的超微結(jié)構(gòu)研究[J]. 海洋與湖沼, 1995, 26(1): 48-52.

[3]曾志南, 李復(fù)雪. 青蛤卵母細(xì)胞發(fā)育過程和卵黃發(fā)生的超微結(jié)構(gòu)研究[J]. 海洋學(xué)報, 1991, 13(5): 679-683.

[4]廖承義, 徐應(yīng)馥, 王遠(yuǎn)隆. 櫛孔扇貝的生殖周期[J].水產(chǎn)學(xué)報, 1983, 7(1):1-13

[5]任素蓮, 王德秀, 王如才. 太平洋牡蠣卵母細(xì)胞發(fā)育及卵黃發(fā)生的超微結(jié)構(gòu)[J]. 中國水產(chǎn)科學(xué), 1999, 6(4):1-5.

[6]袁秀堂, 周一兵, 王麗麗. 墨西哥灣扇貝初級卵母細(xì)胞發(fā)育及卵黃發(fā)生超微結(jié)構(gòu)的初步研究[J]. 大連水產(chǎn)學(xué)院學(xué)報, 2007, 22(1): 16-19.

[7]高巖, 侯林, 周革. 軟體動物腹足類卵子發(fā)生的研究進展[J]. 安徽農(nóng)學(xué)通報, 2008, 14(11): 43-45.

[8]姚韓韓, 董迎輝, 林志華, 等. 泥蚶 4個快速生長家系的遺傳變異分析[J]. 水產(chǎn)學(xué)報, 2011, 35(3):340-347.

[9]孫長森, 林志華, 董迎輝, 等. 泥蚶(Tegillarca granosa)主要經(jīng)濟性狀遺傳參數(shù)的估算[J]. 海洋與湖沼, 2011, 41(6): 907-913.

[10]顧曉英, 曾慶國, 尤仲杰, 等. 泥蚶(Tegillarca granosa)6個微衛(wèi)星引物的分離和鑒定[J]. 海洋與湖沼, 2008, 39(6): 661-664.

[11]朱澤聞, 徐立蒲, 吳信忠, 等. 泥蚶血細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)特征及部分免疫功能[J]. 水產(chǎn)學(xué)報, 2011, 35(10):1494-1502.

[12]潘沙芳, 李太武, 蘇秀榕. 泥蚶血細(xì)胞耐饑餓及抗菌力特性的研究[J]. 水產(chǎn)科學(xué), 2007, 26(1): 22-25.

[13]Bao Y B, Wang Q, Liu H M, et al. A small HSP gene of bloody clam (Tegillarca granosa)involved in the immune response againstVibrioparahaemolyticusand lipopolysaccharide[J]. Fish & Shellfish Immunology,2011, 30(2): 729-733.

[14]解家松, 許婷, 劉瑋, 等. 泥蚶金屬硫蛋白的鑒定、原核重組表達(dá)及其組織細(xì)胞分布[J]. 中國水產(chǎn)科學(xué),2011, 18(5): 955-964.

[15]Jin C H, Li C H, Su X R, et al. Identification and characterization of aTegillarca granosaferritin regulated by iron ion exposure and thermal stress[J]. Developmental & Comparative Immunology, 2011, 35(7):745-751.

[16]李學(xué)鵬, 勵建榮, 等. 泥蚶對重金屬銅、鉛、鎘的生物富集動力學(xué)[J]. 水產(chǎn)學(xué)報, 2008, 32(4): 592-600.

[17]孫慧玲, 方建光, 等. 泥蚶精子的超微結(jié)構(gòu)[J]. 水產(chǎn)學(xué)報, 2000, 24(4): 297-301.

[18]Pipe R K. Oogenesis in the marine musselMytilus edulis: an ultrastructural study[J]. Mar Biol, 1987, 95:405-414.

[19]Galtsoff P S. The American oyster,Crassostrea virginicaGmelin[J]. Fish Bull US, 1964, 64: 1-480.

[20]Dorange G L, Pennec M. Ultrastructural study of oogenesis and oocytic degeneration in Pecten maximus from the Bay of St. Brieuc[J]. Mar Biol, 1989, 103:339-348.

[21]林加涵, 汪德耀. 僧帽牡蠣卵母細(xì)胞卵黃發(fā)生的超微結(jié)構(gòu)研究[J]. 廈門大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版), 1983,22(3): 354-363.

[22]Favard P, Carasso N. Origine et ultrastructure des plaquettes vitellines de la Planorbe[J]. Arch Anat Pathol (Paris), 1958, 47(2): 211-234.

[23]劉德模, 洪水根. 櫛孔扇貝卵母細(xì)胞卵黃發(fā)生的研究[J]. 廈門大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版), 1996, 35(3):412-416.

[24]陳立江, 李春茂, 遲慶宏, 等. 貽貝卵巢超微結(jié)構(gòu)的研究[J]. 大連水產(chǎn)學(xué)院學(xué)報, 1999, 14(2): 14-19.

[25]閻松, 李霞, 穆軍, 等. 皺紋盤鮑卵母細(xì)胞發(fā)育的超微結(jié)構(gòu)和組織化學(xué)觀察[J]. 動物學(xué)報, 2010, 4(1):12-25.

[26]Eckelbarger K J, Bogan E V, Coan F G. Structure of the ovotestis and evidence for hetero-synthetic incorporation of yolk precursors in the oocytes of the nudibranch mollusk,Spurilla neapolitana[J]. Journal of Morphology, 1989, 201: 105-118.

[27]Schechtman A M. Ontogeny of blood and related antigens and their significance for the theory of differentiation [M]. Princeton: Princeton University Press,1955:3-31.

[28]Kevin J E, Craig M Y. Ultrastructure of the Ovary and Oogenesis in the Methane-Seep MolluscBathynerita naticoidea(Gastropoda: Neritidae)from the Louisiana Slope[J]. Invertebrate Biology, 1997, 116(4): 299-312.

[29]Eckelbarger K J, Davis C V. Ultrastructure of the gonad and gametogenesis in the eastern oyster,Crassostrea virginica.I.Ovaryand oogenesis[J]. Marine Biology,1996, 127: 79-87.