彭 勇, 丁云娟, 林 洪, 王靜雪

(中國海洋大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院 食品安全實(shí)驗(yàn)室, 山東 青島 266003)

一株副溶血弧菌噬菌體VPp1的分離鑒定及裂解性能

彭 勇, 丁云娟, 林 洪, 王靜雪

(中國海洋大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院 食品安全實(shí)驗(yàn)室, 山東 青島 266003)

為探究副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)的生物防治方法, 從水產(chǎn)品市場處污水中分離出一株副溶血弧菌噬菌體VPp1。并借助噬菌斑形態(tài)、電鏡、酶切等技術(shù)對(duì)其進(jìn)行了分類鑒定, 同時(shí)測定了其裂解譜、最佳感染復(fù)數(shù)、一步生長曲線以研究其裂解性能。分類鑒定結(jié)果表明, 其核酸是線型雙鏈DNA, 大小在15 kb左右。具有一個(gè)正二十面體的頭部, 頭部直徑大約為44 nm, 無尾, 屬蓋噬菌體科(Tectivirus); 裂解性能研究結(jié)果表明, 其在雙層平板上培養(yǎng) 12 h可形成中心清亮的噬菌斑, 周圍有大而明顯的暈環(huán)。最佳感染復(fù)數(shù)為0.0001, 潛伏期為10 min, 裂解量為90.3, 是符合條件的潛伏期短裂解量大的理想噬菌體, 可用作進(jìn)一步的應(yīng)用。

噬菌體; 副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus); 鑒定; 裂解性能

弧菌病是由弧菌屬(Vibriosis)細(xì)菌引起的一類細(xì)菌性疾病, 已成為海水養(yǎng)殖業(yè)的主要病癥之一, 該病發(fā)病迅速、流行范圍廣、致病性強(qiáng), 給國家和企業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前, 國內(nèi)外已經(jīng)報(bào)道的弧菌病病原主要有副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、鰻弧菌(Vibrio anguillarum)、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、哈維氏弧菌(Vibrio harveyi)、創(chuàng)傷弧菌(Vibrio vulnificus)和河弧菌(Vibrio fluvialis)等[1]。副溶血弧菌的主要感染對(duì)象是對(duì)蝦、海水魚類、文蛤、牡蠣等, 能引起海洋動(dòng)物體表發(fā)炎、充血等癥狀,感染蟹類、貝類會(huì)引起大量死亡[2]。人體食用被感染的食品會(huì)引起腹痛、嘔吐、腹瀉、腸痙攣、惡心和發(fā)燒等典型胃腸炎反應(yīng)[3]。

目前, 弧菌病的防治方法主要是抗菌藥物防治,同時(shí)還有免疫防治、生物防治等[1]?？咕幬锏拇罅渴褂貌粌H污染了養(yǎng)殖環(huán)境, 還導(dǎo)致了致病菌耐藥性不斷增強(qiáng)及養(yǎng)殖動(dòng)物抗病能力的下降。免疫防治的研究剛剛起步, 疫苗的研制大多數(shù)為福爾馬林滅活的全細(xì)胞疫苗, 減毒疫苗還缺乏安全性保障, 商品化生產(chǎn)還未開始。生物防治可大量減少抗菌素及殺蟲劑的使用量, 保護(hù)生態(tài)環(huán)境, 降低病源微生物抗藥性的產(chǎn)生。作為一種安全、綠色的治療方法, 已經(jīng)越來越受到人們的關(guān)注, 具有廣泛的推廣和應(yīng)用前景。

噬菌體(Bacteriophage)是感染細(xì)菌和放線菌的病毒, 是生物防治的主要手段[4]。噬菌體分為烈性噬菌體和溫和噬菌體兩類, 烈性噬菌體可以通過酶的作用破壞細(xì)胞壁, 專一性裂解宿主菌。本研究從水產(chǎn)品交易市場的污水中分離出一株副溶血弧菌噬菌體,在雙層平板上培養(yǎng)12 h出現(xiàn)了清晰的噬菌斑, 屬烈性噬菌體。并對(duì)其進(jìn)行了初步的分類鑒定及裂解性能的研究, 為其代替抗生素應(yīng)用于副溶血弧菌引起的弧菌病的治療奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

分離噬菌體使用的菌種為Vibrio parahaemolyticus17802 (以下簡稱VP 17802), 最初由Fujino[5]等于1953年從日本一個(gè)食物中毒患者體內(nèi)初次分離得到。購自美國典型微生物菌種保藏中心 (American type culture collection, ATCC)。

測定噬菌體裂解譜使用的V. parahaemolyticus菌株VP VIB304、VP VIB461、VP VIB800來自中國海洋大學(xué)應(yīng)用微生物實(shí)驗(yàn)室; VP 17802(sj)、F3-3來自山東出入境檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心; qdfsVp001由中國海洋大學(xué)食品安全實(shí)驗(yàn)室分離自青島周邊海水, 并經(jīng)過生理生化特性測定及16SrDNA序列測定鑒定為一株新的副溶血弧菌。

1.1.2 培養(yǎng)基

2216E培養(yǎng)基, 購自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 SM緩沖液

5.8 g NaCl, 2 g MgSO4·7H2O, 50 mL的1 mol/L pH 7.5 Tris-HCl, 加蒸餾水至1 000 mL, 滅菌備用。

1.2 方法

1.2.1 噬菌體的分離

從青島南山水產(chǎn)品市場處采集商販暫養(yǎng)海產(chǎn)品的海水及污水樣品 4份并編號(hào), 取青島第一海水浴場岸邊海水一份。取上述樣品30 mL加入到50 mL的離心管中經(jīng)5 000 r/min, 10 min離心, 取上清液5 mL加入5 mL 2倍濃度2216E液體培養(yǎng)基中, 同時(shí)加入100 μL對(duì)數(shù)期的VP 17802(OD600= 0.837), 37°C過夜培養(yǎng)。次日, 經(jīng)5 000 r/min, 10 min離心, 取上清液過0.22 μm的微孔濾膜, 得到噬菌體原液, 4°C冰箱保存。

采用雙層平板法, 用滅菌的 SM 緩沖液對(duì)噬菌體原液進(jìn)行適當(dāng)稀釋, 將 100 μL對(duì)數(shù)期的 VP 17802(OD600= 0.837)與100 μL的噬菌體稀釋液分別加入5 mL的2216E半固體培養(yǎng)基中, 混勻, 倒入事先制好的2216E固體瓊脂上, 制成雙層平板。待凝固后倒置, 并于37℃恒溫箱中培養(yǎng)。

1.2.2 噬菌體的純化

方法進(jìn)行噬菌體純化[6], 具體步驟為:用接種針從上述出現(xiàn)噬菌斑單斑的雙層平板上挑取一個(gè)單斑到1 mL的SM 緩沖液中, 混勻, 4°C冰箱過夜。次日, 用滅菌的SM緩沖液將上述噬菌體液進(jìn)行適當(dāng)稀釋, 取100 μL的噬菌體稀釋液與100 μL對(duì)數(shù)期的VP 17802(OD600= 0.837)混合, 37 °C恒溫放置30 min, 再與5 mL半固體培養(yǎng)基混勻倒入事先制好的固體瓊脂平板上制成雙層平板, 待凝固后倒置,并于37 °C恒溫箱中培養(yǎng)。重復(fù)雙層平板純化操作5次得到生物學(xué)純的噬菌體株系。

1.2.3 噬菌斑的形態(tài)觀察

將各株噬菌體分別用SM 緩沖液進(jìn)行適當(dāng)稀釋,取合適稀釋度噬菌體液用雙層平板法做單斑培養(yǎng),觀察各株噬菌體的噬菌斑特征。

1.2.4 噬菌體增殖液的制備

本研究采用固體增殖法, 選取合適稀釋度的長有噬菌斑的雙層瓊脂平板, 加入10 mL SM緩沖液, 4°C冰箱放置過夜。次日, 8 000 r/min, 15 min離心,取上清液過0.22 μm的微孔濾膜, 得到噬菌體增殖液, 4°C冰箱保存。

1.2.5 噬菌體核酸的提取

取效價(jià)達(dá)到 109pfu/mL以上的噬菌體增殖液1 mL經(jīng) 12 000 r/min離心59 min (室溫), 吸去上清,收集噬菌體顆粒, 然后采用 UNIP-10柱式細(xì)菌基因組提取試劑盒 (上海生工) 提取噬菌體的核酸。所提取的噬菌體核酸溶液置于–20℃保存。瓊脂糖凝膠電泳鑒定提取結(jié)果。

1.2.6 噬菌體核酸類型的鑒定

取上述噬菌體的核酸溶液, 用DNaseI、RNaseA及Mung Bean Nuclease 進(jìn)行酶切實(shí)驗(yàn), 瓊脂糖凝膠電泳鑒定酶切結(jié)果。

1.2.7 噬菌體的電鏡觀察

采用磷鎢酸負(fù)染法[7-8], 方法如下: 取 20 μL效價(jià)達(dá)1010pfu/mL的噬菌體液, 滴在銅網(wǎng)上, 自然沉淀2～3 min, 用濾紙從側(cè)面吸去多余液體, 在銅網(wǎng)上加一滴2%的磷鎢酸, 染色10 min, 用濾紙從側(cè)面吸取染液, 干燥后進(jìn)行電鏡觀察并拍照。

1.2.8 噬菌體裂解譜的測定

采用雙層平板法, 取100 μL的噬菌體稀釋液與100 μL對(duì)數(shù)期的副溶血弧菌(OD600= 0.837)混合, 37℃恒溫放置30 min, 再與5 mL半固體培養(yǎng)基混勻倒入事先制好的固體瓊脂平板上制成雙層平板, 待凝固后倒置, 并于37℃恒溫箱中培養(yǎng)。根據(jù)噬菌體的效價(jià), 選擇形成 30～300個(gè)噬菌斑的稀釋度來分析 VPp1對(duì) VP 17802(sj)、F3-3、VP VIB304、VP VIB461、VP VIB800、qdfsVp001 菌株的裂解情況。

1.2.9 噬菌體最佳感染復(fù)數(shù)(MOI值)的測定

按照感染復(fù)數(shù)分別為10、1、0.1、0.01、0.001、0.000 1、0.000 01、0.000 001的比例, 分別將100 μL噬菌體與100 μL VP 17802 ( 3×107CFU/mL )加入10 mL 2216E液體培養(yǎng)基中, 37 °C振蕩培養(yǎng)10 h, 4000 r/min離心15 min去除菌體, 去掉沉淀, 上清液用0.22 μm的膜過濾, 用雙層平板法測定噬菌體的效價(jià), 效價(jià)最高的感染復(fù)數(shù)為最佳感染復(fù)數(shù)。

1.2.10 噬菌體一步生長曲線的測定

一步生長曲線的測定參照杜崇濤[9]的方法。分別將 1 mL 噬菌體和 1 mL對(duì)數(shù)生長期的 VP 17802 (OD600= 0.837)按照感染復(fù)數(shù)為10的比例加入到8 mL 2216E液體培養(yǎng)基中, 37 °C孵育5 min, 12 000 r/min離心30 s, 棄上清, 用2216E液體培養(yǎng)基洗滌兩次。加入等體積37 °C預(yù)熱2216E液體培養(yǎng)基并充分混勻, 迅速置于37 °C振蕩培養(yǎng), 同時(shí)開始計(jì)時(shí), 前30 min內(nèi)每5 min取一次樣, 以后每10 min取一次樣,測定噬菌體的效價(jià)。以感染時(shí)間為橫坐標(biāo), 噬菌體的效價(jià)為縱坐標(biāo), 繪制一步生長曲線。

2 結(jié)果

2.1 噬菌體的分離、純化及噬菌斑的形態(tài)觀察

從青島市南山水產(chǎn)市場的污水中分離出了一株噬菌體VPp1, 通過雙層平板37°C培養(yǎng)12 h發(fā)現(xiàn), VP 17802被侵染, 出現(xiàn)了大量的噬菌斑 (圖1)。純化得到的噬菌斑呈圓形, 中心清亮, 邊緣有大而明顯的暈環(huán), 純化后的噬菌體經(jīng)固體增殖后效價(jià)可達(dá)到1010pfu/mL以上。

圖1 副溶血弧菌噬菌體噬菌斑的形態(tài)Fig. 1 The bacteriophage plaque of phage VPp1

2.2 噬菌體核酸的提取

瓊脂糖凝膠電泳圖(圖2)顯示, 提取的噬菌體核酸純度較好, 濃度較高, 條帶完整。通過Quantity One 軟件分析得噬菌體VPp1的核酸分子量為15738.77 bp。

2.3 噬菌體核酸類型的鑒定

圖2 副溶血弧菌噬菌體的核酸Fig. 2 The nucleic acid of phage VPp1

圖3 副溶血弧菌噬菌體核酸類型的判斷Fig. 3 Determination of the nucleic acid type of bacteriophage

瓊脂糖凝膠電泳圖(圖3)顯示, 噬菌體能被DNaseI降解, 而不能被RNaseA降解, 說明各噬菌體的核酸是 DNA, 而不是 RNA。電泳只有一條條帶,說明噬菌體核酸是線型的。不能被 Mung Bean Nuclease降解, 說明噬菌體核酸是雙鏈的而不是單鏈的。綜合3種酶的酶切結(jié)果表明, 本實(shí)驗(yàn)分離的株噬菌體的核酸是線型雙鏈DNA。

2.4 噬菌體的電鏡觀察

噬菌體在透射電子顯微鏡下的形態(tài)圖(圖4)顯示,噬菌體VPp1有一個(gè)呈正六邊形的頭部, 推測是正廿面體結(jié)構(gòu), 頭部直徑大約為44 nm。無尾。根據(jù)ICTV第八次報(bào)告的最新病毒分類系統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)[10], 該噬菌體屬于蓋噬菌體科(Tectivirus)。

圖4 副溶血弧菌噬菌體VPp1的電鏡照片 (×100000) Fig. 4 Electron micrograph of phage VPp1

2.5 噬菌體裂解譜的測定

2.6 噬菌體最佳感染復(fù)數(shù)(MOI值)的測定

噬菌體最佳感染復(fù)數(shù)的測定結(jié)果分別見表1。

從表1中數(shù)據(jù)可看出, 當(dāng)感染復(fù)數(shù)從10一直降到 0.0001時(shí), 噬菌體的效價(jià)一直在升高, 當(dāng)感染復(fù)數(shù)再降低時(shí), 噬菌體效價(jià)開始降低, 即當(dāng)感染復(fù)數(shù)為0.0001時(shí), 噬菌體效價(jià)達(dá)到最高值2.62±0.03×1010,所以噬菌體VPp1的最佳感染復(fù)數(shù)為0.0001。

2.7 噬菌體一步生長曲線的測定

噬菌體 VPp1的一步生長曲線測定結(jié)果分別見圖5。

據(jù)圖5, 可以明顯看出噬菌體VPp1感染宿主菌后10 min內(nèi), 噬菌體的量沒有增加, 即潛伏期約10 min; 噬菌體感染宿主菌后 10～30 min, 噬菌體的量急速增加, 即噬菌體 VPp1的裂解期約 20 min; 在隨后的90 min里, 噬菌體的量變化不大, 即噬菌體進(jìn)入到穩(wěn)定期。根據(jù)裂解量計(jì)算公式: 裂解量=裂解末期噬菌體效價(jià)/感染初期宿主菌濃度=2.71×109/3× 107=90.3。

表1 噬菌體VPp1最佳感染復(fù)數(shù)的測定Tab. 1 Determination of bacteriophage VPp1 MOI

圖5 噬菌體VPp1的一步生長曲線Fig. 5 One-step growth curve of phage VPp1

3 討論

本研究曾于4、5月份進(jìn)行過多次噬菌體的分離,均一無所獲。6月初的一次分離成功地分離出大量噬菌體, 這說明氣溫對(duì)噬菌體分離的成功與否有很大影響, 原因可能是氣溫低時(shí)水體中宿主菌的含量極少, 致使噬菌體含量極少, 所以很難分離出來。藺紅蘋[11]等的研究也提到過類似的情況。另外, 楊吉霞[12]在研究中提到從赤潮海水中分離噬菌體會(huì)更容易,原因是赤潮海水藻類爆發(fā)性增殖, 而藻類與細(xì)菌、病毒之間存在著相生相克、錯(cuò)綜復(fù)雜的互相作用, 藻類增殖后, 細(xì)菌、病毒的數(shù)量也會(huì)隨之改變。這也許不失為一個(gè)好辦法。

目前國際上噬菌體的分類標(biāo)準(zhǔn)尚不完善, 2005年國際病毒分類委員會(huì) (ICTV) 第八次報(bào)告將噬菌體進(jìn)行了比較系統(tǒng)的分類與命名。其依據(jù)核酸類型、形態(tài)結(jié)構(gòu)、基本特性及宿主菌類型等特征將噬菌體劃分為群、目、科、屬、種5個(gè)階級(jí), 種下根據(jù)實(shí)際需要可設(shè)立亞種[13]。本研究分離出的噬菌體核酸是線型雙鏈 DNA, 根據(jù)第八次報(bào)告的分類方法, 應(yīng)首先劃分為群I。噬菌體無尾, 根據(jù)其形態(tài)特征可劃分為蓋病毒科蓋噬菌體屬。

阿花的淚又滾落在白凈的臉上。我對(duì)誰都沒說過，為了生存，為了打拼，我不得不掩飾自己，不得不虛與委蛇。其實(shí)在南方，很多人不得不這樣來掩飾自己，假身份證，假文憑，假夫妻，假城里人，假洋鬼子……比比皆是。我隱瞞那段歷史，是怕你們看不起我，是怕失去做女人的優(yōu)勢(shì)，是怕在商場難以立足。

噬菌體裂解譜測定結(jié)果顯示, 本研究提取的副溶血弧菌噬菌體的裂解譜范圍并不廣泛, 但其能形成透亮的噬菌斑, 說明其均有很強(qiáng)的裂解能力。另外,多方面的研究已表明[14], 雖然噬菌體對(duì)宿主菌有高度特異性, 但通過人工改造, 可以擴(kuò)展噬菌體的裂解范圍。本實(shí)驗(yàn)提取的噬菌體有待于用各種方法擴(kuò)展其宿主譜, 為其在致病菌檢測方面的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

感染復(fù)數(shù), 又稱感染倍數(shù), 是為研究病毒感染與產(chǎn)出之間量效關(guān)系而提出的一個(gè)重要生物學(xué)指標(biāo)[15]。噬菌體的感染復(fù)數(shù)是指初始感染時(shí), 加入噬菌體的數(shù)量與加入宿主菌數(shù)量的比值。不同的噬菌體的感染復(fù)數(shù)是不同的, 存在一個(gè)最佳用量和最大產(chǎn)出問題, 即最佳感染復(fù)數(shù)。最佳感染復(fù)數(shù)與噬菌體的種類、結(jié)構(gòu)以及宿主菌有關(guān), 最佳感染復(fù)數(shù)反映了噬菌體的裂解能力。本研究分離的噬菌體VPp1的最佳感染復(fù)數(shù)分別為 0.0001, 邱德全[16]等分離的副溶血弧菌噬菌體最佳感染復(fù)數(shù)在0.1～10, Onanong[17]等測得食竇魏斯氏菌噬菌體感染宿主菌的最佳感染復(fù)數(shù)在0.01, 與之相比較, 可知噬菌體VPp1具有較強(qiáng)的裂解能力。

一步生長曲線可反映噬菌體 3個(gè)重要的特征參數(shù): 潛伏期、裂解期、裂解量?？蔀槭删w的治療、檢測等應(yīng)用研究篩選出潛伏期短裂解量大的噬菌體。本研究分離的噬菌體VPp1的潛伏期較短, 裂解量達(dá) 90.3, 表明其裂解能力是非常強(qiáng)的, 可進(jìn)一步應(yīng)用于噬菌體治療、檢測等方面。

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(本文編輯: 譚雪靜)

Isolation, identification and lysis properties analysis of aVibrio parahaemolyticusphage VPp1

PENG Yong, DING Yun-juan, LIN Hong, WANG Jing-xue
(Food Safety Laboratory, College of Food Science and Engineering, Ocean University of China, Qingdao, 266003, China)

Dec.,2, 2011

phage;Vibrio parahaemolyticus; identification; lysis properties

In order to develop an effective bio-controlling method againstVibrio parahaemolyticus, a virulent phage VPp1 was isolated from aquatic sewage water and identified by plaque shapes, restriction, electronic microscope and lysis properties analyses. The results revealed that VPp1 contains a linear double stranded DNA with 15kb in size and it has an icosahedral head with 44 nm in diameter and does not have a tail, suggesting that VPp1 belongs to theTectivirusfamily. VPp1 forms plaques with transparent center and large halo after culture in double-layer agar plate for 12 hours and its optimum MOI value was 0.0001. A one-step growth experiment showed that the latent period and burst size were estimated at 10 min and 90.3 phage particles/infected cell, respectively. VPp1 could be widely used because of its short latent period and large burst size.

Q939.48

A

1000-3096(2013)01-0096-06

2011-12-02;

2012-03-25

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31071540); 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金資助項(xiàng)目(nycytx-50); 山東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(ZR2011CQ024)

彭勇(1987-), 男, 山東濰坊人, 碩士研究生, 主要從事食品質(zhì)量與安全方面研究, 電 話: 0532-82031550, E-mail: pengyongpy520@163.com; 王靜雪, 通信作者,電話: 0532-82032389, E-mail: snow@ouc.edu.cn