王鳳玲，張小霞，蔡棟梁

(佳木斯大學附屬第一醫(yī)院老年病科，黑龍江佳木斯154003)

近年來，肺癌在我國乃至全世界的發(fā)病率和死亡率已經(jīng)躍居惡性腫瘤的首位，其中非小細胞肺癌(non－small cell lung cancer，NSCLC)占肺癌總數(shù)的85%，其5年生存率僅16%，嚴重威脅著人類的健康。然而由于肺癌早期癥狀表現(xiàn)不明顯，往往錯過最佳診斷和治療時機，發(fā)現(xiàn)時大部分已處于中晚期，失去了手術機會，因此改進肺癌的診治水平，提高患者的生存率，對改善患者預后和增加生存率具有重要意義。水通道蛋白(aquaporins，AQPs)是一組參與跨細胞膜轉運水的膜通道蛋白家族，根據(jù)其通透性的不同又分為水通道和水－甘油通道兩個亞族，AQP3屬于后者，通透水及其他小分子物質如甘油、尿素等，在液體穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著重要作用。目前已有研究證實，AQP3在多種不同來源的腫瘤中表達水平較高，尤其是在侵襲性強的腫瘤中。但 AQP3在肺癌中的研究甚少，本課題采用免疫組織化學方法和酶聯(lián)免疫法(ELISA)檢測AQP3在非小細胞肺癌中的表達特性，探討其在肺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用及其作為診斷和治療肺癌的新的分子靶點的潛在可能性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

取2012－02～2013－06期間佳木斯大學附屬第一醫(yī)院收住的非小細胞肺癌手術患者術后組織標本和血清標本各42例為實驗組，20例癌旁組織(距癌腫超過5cm以上的正常肺組織)及20例健康體檢者血清為對照組。非小細胞肺癌患者男24例，女18例;年齡36～87歲，平均(63±11)歲;腺癌22例，鱗癌20例;TNM分期:I、II期26例，III期16例;組織病理類型:高、中分化19例，低分化23例。入選標準:所選患者均為首次手術且達到完全性切除并經(jīng)病理學確診，術前均未接受放化療，1個月內(nèi)未接受全身或局部激素治療，未應用過抗腫瘤藥物，排除合并有哮喘、肺囊性纖維化、慢性阻塞性肺疾病及不動纖毛綜合征等其他肺部疾病的患者。均經(jīng)患者家屬知情同意。

1.2 主要試劑

兔抗人AQP3多克隆一抗，免疫組化染色試劑盒，人水通道蛋白－3 ELISA試劑盒，所需試劑均購自天津索羅門生物技術有限公司。

1.3 實驗方法

①將待測標本統(tǒng)一切成4μm厚石蠟切片，其中每份標本備2張切片行常規(guī)HE染色及免疫組織化學染色。②NSCLC患者在手術治療前抽空腹靜脈自凝血2mL室溫靜置1h，離心(5000r/min)，分離血清，冷凍保存，集中用ELISA法測血清中AQP3的濃度。各步驟嚴格按照檢測試劑盒說明進行。

1.4 結果判定

①免疫組化SP法:由兩位有經(jīng)驗的病理科醫(yī)師對染色結果進行評判。以細胞膜或(和)細胞質出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒為陽性染色。參照Ozdemir等的評分標準，按染色強度和染色細胞百分數(shù)進行評分，其中染色強度評分標準:淺黃色為1分、棕黃色為2分、棕褐色為3分;染色細胞百分數(shù)評分標準:染色細胞＜1/3為1分、1/3～2/3為2分、＞2/3為3分。每張切片染色程度與染色細胞數(shù)得分相乘為其最后得分，得分＜1為陰性，1～3為弱陽性(+)，4～6為中陽性(++)，7～9為強陽性(+++);表達程度的劃分界限:(－)及(+)為陰性表達，(++)及(+++)為陽性表達。②免疫吸附實驗:根據(jù)AQP3的標準品濃度及其對應的OD值計算出標準曲線的直線回歸方程，以標準品濃度為橫坐標，OD值為縱坐標繪制標準曲線，再根據(jù)樣品的OD值計算出相應的的樣品濃度。

1.5 統(tǒng)計學處理

采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料兩組間比較采用χ2檢驗，計量資料采用兩樣本t檢驗。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

圖1 AQP3在鱗癌中的表達(SP×400)

圖2 AQP3在腺癌中的表達(SP×400)

2 結果

2.1 AQP3在非小細胞肺癌患者腫瘤組織中的表達

實驗組患者的腫瘤組織標本陽性表達30/42例，陽性率為71.43%，對照組陽性表達6/20例，陽性率為30%，兩者之間的差異具有顯著統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

2.2 AQP3在非小細胞肺癌患者血清中的表達

血清AQP3的表達在實驗組患者組為(3.53±1.39)ng/L，而對照組為(2.80±1.07)ng/L，實驗組表達量明顯高于對照組，兩組間差異具有顯著統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

2.3 AQP3在不同病理因素非小細胞肺癌患者的癌組織內(nèi)和血清中的表達

AQP3在非小細胞肺癌組織中的表達水平與肺癌患者的性別、年齡、吸煙情況及 TNM分期均無明顯相關性(P＞0.05)，而AQP3在腺癌中的表達陽性率明顯高于鱗癌(P＜0.05)，中、高分化組的表達陽性率明顯低于低分化組(P＜0.05)，有淋巴結轉移組的表達陽性率明顯高于無淋巴結轉移組(P＜0.05)，見表1。

表1 AQP3在肺癌患者癌組織中的表達與臨床病理因素的關系

AQP3在非小細胞肺癌患者血清中的表達水平與患者的性別、年齡、吸煙情況無相關性(P＞0.05)，而在腺癌中表達明顯高于鱗癌(P＜0.05)，在低分化組中表達高于中、高分化組(P ＜0.05)，臨床分期為III期組的表達高于I、II期(P＜0.05)，有淋巴結轉移組高于無淋巴結轉移組(P ＜0.05)，見表2。

表2 AQP3在肺癌患者血清中的表達與臨床病理因素的關系

3 討論

水通道蛋白是一組能介導水的快速跨膜轉運的膜通道蛋白，分子量約30kDa，屬于固有蛋白家族。該蛋白能增加細胞膜的通透性，參與水的分泌、吸收以及細胞內(nèi)外平衡的調(diào)節(jié)。首次被人類認識的水通道蛋白是AQP1，是由Argre等鑒定人類Rh血型抗原時于紅細胞膜上偶然發(fā)現(xiàn)的。隨著研究的不斷進展，目前已發(fā)現(xiàn)的該家族成員已有13個，即AQP0～12，稱為水通道蛋白家族[1，2]?，F(xiàn)對于呼吸道中AQPs的分布研究較明確的有 AQP1、3、4、5四種，其中 AQP3主要分布在氣管和支氣管的假復層上皮細胞基底膜以及部分肺泡Ⅱ型上皮細胞[3]。

惡性腫瘤細胞的快速生長、侵襲和轉移除了需要蛋白質、脂類等營養(yǎng)物質外，還需要大量快速跨膜轉運的水，近年來研究發(fā)現(xiàn)，AQP在腫瘤細胞的生長、血管生成、侵襲和轉移中起重要作用[4]。研究表明，水通道蛋白可能參與腫瘤細胞的發(fā)生、轉移過程[5]。有研究證實，AQP3在腫瘤細胞及腫瘤新生血管內(nèi)皮細胞中均表達，提示AQP3參與腫瘤的血管生成[6]。推測AQP3表達的改變可能既影響了水分子的運輸，又影響了細胞的生命活動。本實驗通過兩種方法檢測了AQP3在肺癌中的表達情況，肺癌患者的癌組織和血清中AQP3的表達水平均顯著高于正常對照組，其中，腺癌患者、低分化患者及有淋巴結轉移患者肺癌組織中AQP3的表達水平分別高于鱗癌患者、中(高)分化患者及無淋巴結轉移患者。這表明在肺癌發(fā)生過程中，隨著惡性腫瘤細胞的增加，對水分子快速跨膜轉運的需求增多，進而AQP3的表達也隨之增加，由AQP3形成的水通道可能改變了癌變組織中細胞內(nèi)的滲透壓，轉運了大量的小分子物質，加快了腫瘤細胞的快速增殖并向周圍基質浸潤，提示AQP3在肺癌發(fā)生、發(fā)展過程中可能起重要作用。另外，血清中AQP3水平上調(diào)是腫瘤發(fā)生過程的重要事件，也提示血清AQP3可作為肺癌診斷的輔助手段。在肺癌患者中，血清AQP3水平與TNM分期顯著相關，而在肺癌組織中AQP3表達水平與TNM分期的相關性無顯著的統(tǒng)計學意義，這種差異提示可能血液中AQP3的變化較組織中的變化更為敏感，也可因試驗方法不同所致，有待進一步研究證實，研究樣本量較少也可能造成這種差異。

綜上所述，AQP3可能與非小細胞肺癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關，肺組織中及血清中AQP3表達水平的檢測可能作為NSCLC的輔助診斷指標，尤其是血清中AQP3水平的檢測具有相對無創(chuàng)、標本易得、可動態(tài)觀察等優(yōu)點，值得進一步推廣。另外，本實驗還提示AQP3抑制劑有待開發(fā)。

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