張富運(yùn)，楊建華，王 蕾，趙中男，熱吉普

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨一科，黑龍江佳木斯154003)

脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)是一種以損傷平面以下感覺、運(yùn)動(dòng)功能完全喪失為主要癥狀的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的嚴(yán)重創(chuàng)傷。目前對SCI的治療仍是難點(diǎn)，隨著神經(jīng)生物學(xué)和干細(xì)胞技術(shù)的迅速發(fā)展，骨髓單個(gè)核細(xì)胞(bone marrow mononuclear cells，BMMNCs)移植治療 SCI亦取得了重要進(jìn)展[1]，但其作用機(jī)制仍不清楚。生長因子是脊髓微環(huán)境的重要組成部分，其對神經(jīng)元的存活、神經(jīng)修復(fù)以及軸突生長都具有重要促進(jìn)或抑制作用，其中，神經(jīng)營養(yǎng)因子3(neurotrophin－3，NT－3)促進(jìn)損傷脊髓功能恢復(fù)是頗受肯定的[2]。為此，本實(shí)驗(yàn)擬建立大鼠脊髓半橫斷模型，觀察BMMNCs在不同時(shí)間點(diǎn)對大鼠后肢功能及NT－3表達(dá)的影響，進(jìn)而探討B(tài)MMNCs移植治療SCI的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級Wistar大鼠(長春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司)120只，雌雄各半，體重180～220g。

1.2 主要試劑

兔抗鼠NT－3多克隆抗體(武漢博士德公司，批號:DB1－07E19B)，即用型SABC－POD(兔IgG)試劑盒(武漢博士德公司，編號:SA1022)，大鼠淋巴細(xì)胞分離液(天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司，編號:LTS1083)，滅菌肝素生理鹽水。

1.3 骨髓單個(gè)核細(xì)胞的分離和計(jì)數(shù)

無菌條件下取大鼠雙側(cè)股骨和脛骨，用注射器吸取無菌生理鹽水(含肝素鈉)沖洗骨髓腔于離心管，用Ficoll密度梯度離心法分離出BMMNCs，光學(xué)顯微鏡下臺盼蘭計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)，檢測細(xì)胞活性為90%，加無菌PBS液制成BMMNCs懸液，濃度調(diào)整為6×1011/L，4℃保存，2h內(nèi)移植。

1.4 模型制備和動(dòng)物分組

大鼠麻醉成功后妥善固定，術(shù)區(qū)常規(guī)處理，按肋骨確定T10脊髓，行后正中切口，咬除T9～10棘突及相應(yīng)椎板，于T10椎骨平面打開椎管，充分暴露脊髓背面及兩側(cè)，用外科手術(shù)尖刀于脊髓中央動(dòng)脈向左完全離斷，生理鹽水沖洗，逐層關(guān)閉術(shù)區(qū)，術(shù)后常規(guī)消毒，成功制成脊髓半橫斷模型。術(shù)后腹腔注射青霉素防感染，定時(shí)排便。120只大鼠，其中6只提取BMMNCs，剩余大鼠造模后2d死亡10只，剩余大鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組(C組)48只，分別于橫斷面頭尾方向采用局部微量注射法注射15μL BMMNCs懸液;對照組(B組)48只，按C組的方法注射15μL PBS液;假手術(shù)組(A組)8只，僅切除對應(yīng)的椎板并按C組的方法注射15μLPBS液。

1.5 術(shù)后動(dòng)物BBB評分

各組大鼠在術(shù)后1、3、5、7、14 和21d 按 BBB 評分標(biāo)準(zhǔn)[3]測試后肢功能。評定前排空膀胱，將大鼠放入一開口大盆(底部為帶條紋的地板)，輕敲盆壁，使其爬行，記錄動(dòng)物肢體運(yùn)動(dòng)及其協(xié)調(diào)情況。

1.6 動(dòng)物組織取材

各組大鼠造模成功1d、3d、5d、7d、14d和 21d取8只行BBB評分后，10%水合氯醛腹腔注射麻醉;沿肋弓下緣打開腹腔，顯露心臟，用麻醉科套管針刺入左心室，拔出針芯快速灌注生理鹽水，同時(shí)將右心耳剪開放血，灌注至腸系膜血管變白為止;先快后慢灌注含4%多聚甲醛、0.1 M磷酸鹽緩沖液共500mL進(jìn)行固定，迅速于脊髓斷面向頭尾各1cm處取出完整脊髓，置于4%多聚甲醛固定，4℃冰箱中保存。

1.7 NT－3檢測

組織石蠟包埋后制成矢狀切片，按免疫組化SABC試劑盒說明書操作。光學(xué)顯微鏡下以胞漿或胞核出現(xiàn)棕褐色或棕色免疫產(chǎn)物為 NT－3陽性表達(dá)。用 Leica Application Suite.V3照相系統(tǒng)在 Leica Ver3.4.0顯微鏡下攝片，Leica Qwin pro.V3.5.1圖像分析系統(tǒng)下行細(xì)胞平均灰度值測量。每張切片在損傷脊髓區(qū)隨機(jī)選取5個(gè)完整而不重疊的高倍鏡視野(×200)，求其灰度值進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。圖像分析系統(tǒng)檢測精度最黑為0，最亮為255。免疫陽性產(chǎn)物越多，圖像顯色越深，灰度值越小，反之，灰度值越大，陽性產(chǎn)物表達(dá)越少。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件，對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用方差分析和t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BBB評分實(shí)驗(yàn)結(jié)果

見表1，術(shù)后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)A組后肢功能評分與B、C組相比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);B組和C組比較，各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

表1 各組大鼠BBB評分比較(±s，n=8)

表1 各組大鼠BBB評分比較(±s，n=8)

與A組比較，aP ＜0.05;與B組比較，bP ＜0.05。

組別1d 3d 5d 7d 14d 21d A 組 21.00±0.00 21.00±0.00 21.00±0.00 21.00±0.00 21.00±0.00 21.00±0.00 B 組 0.55±0.01a 0.67±0.01a 1.94±0.01a 2.81±0.02a 5.20±0.02a 7.04±0.01a C 組 0.92±0.01a，b 1.39±0.02a，b 3.17±0.01a，b 5.08±0.01a，b 6.90±0.02a，b 9.24±0.06a，b

2.2 各組大鼠受損脊髓組織中NT－3的表達(dá)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1～3，表2，圖中標(biāo)尺為100um。顯微鏡下見A、B、C三組NT－3免疫陽性細(xì)胞主要分布于灰質(zhì)，胞漿著色多見，以大運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元為主，也可見染色較弱的毛刷狀陽性產(chǎn)物。表2中可見假手術(shù)組與實(shí)驗(yàn)組、對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);各時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組平均灰度值與對照組比較明顯較低(P＜0.05);實(shí)驗(yàn)組平均灰度值于術(shù)后1d、3d、5d、7d 逐漸下降，14d、21d 逐漸上升，即 NT －3的表達(dá)先增多，7d達(dá)高峰，隨后減少;對照組平均灰度值于術(shù)后1d、3d、5d 逐漸下降，7d、14d、21d 逐漸上升，即 NT －3 的表達(dá)亦是先增多，5d達(dá)高峰，隨后減少;各時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組平均灰度值與對照組比較明顯較低(P＜0.05)。

圖1 實(shí)驗(yàn)組7d脊髓灰質(zhì)(免疫組織化學(xué)ABC法，×200)

圖2 對照組7d脊髓灰質(zhì)(免疫組織化學(xué)ABC法，×200)

圖3 假手術(shù)組脊髓灰質(zhì)(免疫組織化學(xué)ABC法，×200)

表2 各組各時(shí)點(diǎn)NT－3平均灰度值比較(±s，n=8)

表2 各組各時(shí)點(diǎn)NT－3平均灰度值比較(±s，n=8)

與A組比較，aP ＜0.05;與B組比較，bP ＜0.05。

組別1d 3d 5d 7d 14d 21d A 組 184.59±1.07 182.30±0.33 185.73±0.47 186.11±0.17 189.24±0.19 183.62±0.30 B 組 205.49±1.09a 194.25±0.03a 180.07±1.41a 184.61±0.29a 186.98±0.20a 197.33±0.08a C 組 196.13±0.46a，b 185.27±0.26a，b 174.83±0.72a，b 163.70±0.30a，b 170.12±0.46a，b 179.49±0.62a，b

3 討論

SCI是神經(jīng)系統(tǒng)一種嚴(yán)重的疾病，一旦發(fā)生，往往意味著患者喪失自理的能力，對患者家庭和社會帶來了沉重的負(fù)擔(dān)。SCI難以修復(fù)是多因素作用的結(jié)果，其中BMMNCs移植治療SCI近年來受到臨床和科研學(xué)者的廣泛關(guān)注。BMMNCs是指骨髓中的細(xì)胞核為單個(gè)的總稱，包括造血干細(xì)胞，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，內(nèi)皮祖細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞等，是含有多種細(xì)胞成分的細(xì)胞群。有學(xué)者證實(shí)[4～6]，BMMNCs可直接分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞，形成新的血管;或者以自分泌或旁分泌的方式分泌促血管生長因子從而促進(jìn)血管新生，骨髓單個(gè)核細(xì)胞群內(nèi)眾多不同的細(xì)胞可能在損傷脊髓的修復(fù)中起著重要的作用。和骨髓中某種純化的細(xì)胞相比，BMMNCs可提供細(xì)胞之間協(xié)助的誘導(dǎo)環(huán)境，進(jìn)而為損傷脊髓修復(fù)提供更好的微環(huán)境，直接移植可防止體外擴(kuò)增帶來的多元分化潛能和自動(dòng)遷移性的下降[7]，BMMNCs移植治療SCI是有效的[8]，但其作用機(jī)制尚不十分清楚。

NT－3是一種廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)營養(yǎng)因子，有學(xué)者證明[9]其能阻止受損神經(jīng)元萎縮，提高神經(jīng)細(xì)胞的存活量，而且與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育有關(guān)[10]。Ding Y等[11]研究發(fā)現(xiàn)脊髓損傷后NT－3在受損脊髓灰質(zhì)的表達(dá)量上調(diào)，說明受損脊髓對內(nèi)源性NT－3的需求增加，NT－3表達(dá)升高可改善脊髓損傷大鼠后肢功能，這可能與其能夠促進(jìn)脊髓軸突再生有關(guān)[12]。

本實(shí)驗(yàn)BBB評分、免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示大鼠后肢功能與NT－3的調(diào)節(jié)密切相關(guān)。對照組與假手術(shù)組相比:術(shù)后1d、3d的NT－3表達(dá)較少，逐漸增多的，于術(shù)后5d達(dá)峰，而后逐漸下降接近假手術(shù)組，BBB評分顯示對照組大鼠后肢功能逐漸改善，提示NT－3的表達(dá)增高可能與SCI大鼠后肢功能好轉(zhuǎn)有直接關(guān)系，這與Ding Y等的研究是一致的。實(shí)驗(yàn)組與對照組相比:NT－3的表達(dá)量明顯較高，BBB評分也顯示大鼠后肢功能較好，提示BMMNCs可改善SCI大鼠的后肢功能且可能與NT－3的表達(dá)增高相關(guān)。免疫組化和BBB評分檢測表明:實(shí)驗(yàn)組大鼠后肢功能與受損脊髓組織中NT－3的表達(dá)基本呈正相關(guān)趨勢，提示實(shí)驗(yàn)組大鼠后肢功能的改變可能與BMMNCs移植后調(diào)節(jié)NT－3的表達(dá)有關(guān);NT－3可提高神經(jīng)元的存活，促進(jìn)軸突再生，而軸突完整性是脊髓功能發(fā)揮的重要基礎(chǔ)，BMMNCs可能通過提高NT－3的表達(dá)促進(jìn)軸突生長，神經(jīng)細(xì)胞存活，進(jìn)而改善脊髓功能。

據(jù)上所述，BMMNCs對SCI大鼠后肢功能有改善作用，受損脊髓組織中NT－3的表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而修復(fù)損傷脊髓可能是其機(jī)制之一。但SCI恢復(fù)過程是復(fù)雜的，是多因素作用的結(jié)果，受損脊髓組織中NT－3的表達(dá)上調(diào)是否是BMMNCs改善SCI大鼠行為功能的主要機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

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