張正雄， 游 洋

目前，膠質(zhì)瘤的治療仍以手術(shù)為主，但有部分患者不能耐受或不愿手術(shù)。射頻熱療是近些年發(fā)展起來的治療膠質(zhì)瘤的新方法，其創(chuàng)傷小，患者耐受性好，目前臨床已開始應(yīng)用。然而，在射頻熱療過程中存在治療時(shí)間及溫度控制隨意性大，主觀性強(qiáng)，尚沒有嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)，患者易產(chǎn)生腦水腫等嚴(yán)重并發(fā)癥等問題。本研究通過建立膠質(zhì)瘤大鼠模型，使用不同的溫度和作用時(shí)間對(duì)荷瘤大鼠進(jìn)行處理，以期探明膠質(zhì)瘤大鼠射頻熱療的最佳作用時(shí)間及最適作用溫度，為臨床應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料 SD大鼠156只，4周齡，雄性，體重(245±10)g，由東南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供［SYXK(蘇)2007-0011］。C6細(xì)胞株購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù);胎牛血清購(gòu)自杭州四季青公司;馬血清、F12-K培養(yǎng)基、胰蛋白酶、PBS均購(gòu)自GIBCO公司。江灣I型C動(dòng)物立體定向儀、leksell射頻儀(東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院神經(jīng)外科)，牙科磨鉆(東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院口腔科)，7.0T德國(guó)bruker公司生產(chǎn)實(shí)驗(yàn)小動(dòng)物專用磁共振(東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)影像系)，電子分析天平、恒溫烘箱(東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室)。

1.2 膠質(zhì)瘤細(xì)胞培養(yǎng) C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞培養(yǎng)于5%CO2氣體濃度，37℃培養(yǎng)箱，培養(yǎng)液為加入15%馬血清及2.5%胎牛血清的F-12K培養(yǎng)液。于細(xì)胞指數(shù)生長(zhǎng)期胰酶消化并收集細(xì)胞，制成105個(gè)/μL細(xì)胞懸液以供種植腫瘤(懸液不含血清)。

1.3 膠質(zhì)瘤模型建立 所有大鼠術(shù)前禁食禁水，麻醉前30 min肌肉注射阿托品0.05 mg抑制呼吸道分泌，并在實(shí)驗(yàn)的過程中每小時(shí)肌肉注射阿托品0.05 mg維持。腹腔注射戊巴比妥(40 mL·kg－1)進(jìn)行麻醉，體溫控制在37.5℃。麻醉后將大鼠固定于江灣Ⅰ型立體定位儀上，頭部正中1 cm切口切開頭皮，暴露前囟，以前囟為原點(diǎn)，向后1.5 mm，向右旁開3.0 mm用牙科磨鉆打一直徑為1 mm的小孔。微量進(jìn)樣針將10 μL細(xì)胞懸液緩慢注入硬腦膜下5 mm(進(jìn)6mm，退1mm)處的腦組織中，停針5 min后退針，骨蠟封閉骨孔，清洗切口后縫合。

1.4 建模判定 大鼠出現(xiàn)活動(dòng)減少，進(jìn)水飲食進(jìn)行性減少等情況，體重亦在術(shù)后10 d減少，再經(jīng)MRI及病理驗(yàn)證，判定建模是否成功。

1.5 分組及處理 建模成功大鼠隨機(jī)分成4組:44℃組、58℃組、72℃組、86℃組，每組36只。各組的36只大鼠再隨機(jī)分成6個(gè)小組，每組6只，射頻持續(xù)時(shí)間分別為 50 s、70 s、90 s、110 s、130 s、150 s。

1.6 射頻熱療方法 按以上分組對(duì)荷瘤大鼠進(jìn)行射頻熱凝:腹腔注射4%戊巴比妥鈉(40 mg·kg－1)，將荷瘤大鼠麻醉后，固定于立體定向儀框架，將三維坐標(biāo)調(diào)零。常規(guī)消毒后切開頭皮約1 cm，剝離骨膜，用牙科磨鉆將原建模時(shí)的骨孔擴(kuò)大為直徑3 mm的骨孔，沿此孔將射頻電極緩慢步進(jìn)至預(yù)定坐標(biāo)，開啟射頻儀，按以上分組條件分別給予射頻熱凝，結(jié)束后緩慢退出射頻電極，鉆孔使用骨蠟覆蓋，常規(guī)縫合傷口。整個(gè)過程在超凈工作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行，術(shù)后無需抗生素防治感染。

1.7 大鼠腦水含量測(cè)定 大鼠術(shù)后12小時(shí)行磁共振掃描，測(cè)量腫瘤毀損灶直徑。術(shù)后24小時(shí)后，以頸椎離斷法處死大鼠，立即完整摘取整個(gè)腦組織，稱濕重，記為WW水腫，再將標(biāo)本切碎放于90℃烘箱48 h，至恒重后測(cè)干重(DW水腫)。腦組織含水量(S水腫)按公式:S水腫= ［(WW水腫－ DW水腫)/WW水腫］ ×100%計(jì)算。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS11.5對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，各組間比較使用方差分析，兩兩比較使用q檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 建模結(jié)果 因感染、手術(shù)操作等因素，術(shù)后有3只大鼠死亡，15天后所有剩余153只建模大鼠給予磁共振檢查，其中4只大鼠磁共振未見異常表現(xiàn)，余149只大鼠磁共振異常(圖1)。隨機(jī)選取3只斷頭處死后解剖了解C6膠質(zhì)瘤成瘤情況，見腦接種處均已成瘤。建模成功率為95.5%。

2.2 各組腫瘤毀損灶直徑的比較(表1) 各組毀損灶直徑隨熱療持續(xù)時(shí)間增長(zhǎng)呈增大趨勢(shì)，44℃組、58℃組呈持續(xù)增大(P＜0.05)，72℃組、86℃組在90 s后增大趨于平緩(P＞0.05)。

2.3 各組腦水含量的比較(表2) 同一熱療時(shí)間下，各組間腦水含量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均P＞0.05)。腦水含量隨熱療持續(xù)時(shí)間增長(zhǎng)呈增加趨勢(shì)，90 s后各組均增加較劇烈，130 s以后趨于平緩。

圖1 建模成功大鼠影像學(xué)及病理學(xué)表現(xiàn)

表1 不同溫度和作用時(shí)間下各組毀損灶最大直徑(單位:mm)

表2 不同溫度和作用時(shí)間下各組腦水含量表(單位:g)

3 討論

目前，膠質(zhì)瘤的治療仍以手術(shù)治療為主，但由于腫瘤呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，與腦組織無明確分界，難以徹底切除，術(shù)后進(jìn)行放射治療、化學(xué)治療、免疫治療極為必要，但各種療法均難以達(dá)到根治目的，這已成為神經(jīng)科學(xué)最富挑戰(zhàn)性又亟待解決的問題［1］。

利用射頻治療腫瘤是腫瘤局部透熱治療的一種，以影像學(xué)引導(dǎo)或直接將電極針導(dǎo)入腫瘤組織，通過射頻在電極針周圍產(chǎn)生極性分子震蕩而發(fā)熱，從而使細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)變性、細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層溶解，產(chǎn)生細(xì)胞凝固性壞死，達(dá)到治療腫瘤的目的［2］。腫瘤組織具有微血管發(fā)育不良和其呈缺氧、低營(yíng)養(yǎng)、低pH的特點(diǎn)，使瘤細(xì)胞對(duì)熱的耐受性低，比正常細(xì)胞更易被殺傷，對(duì)熱更具有敏感性［3］。

目前微創(chuàng)射頻熱凝治療腦腫瘤在臨床上已見使用，但仍存在諸如溫度點(diǎn)的選擇、術(shù)后并發(fā)癥防治等問題［4］。本實(shí)驗(yàn)針對(duì)腫瘤射頻熱凝治療的具體加熱溫度、加熱時(shí)間進(jìn)行大鼠模型研究。對(duì)C6膠質(zhì)瘤模型大鼠分別行44℃，58℃，72℃，86℃ 4個(gè)溫度條件下 50 s、70 s、90 s、110 s、130 s 及 150 s 6 種時(shí)間的射頻加熱。結(jié)果表明:各組毀損灶直徑隨熱療持續(xù)時(shí)間增長(zhǎng)呈增大趨勢(shì)，44℃組、58℃組呈持續(xù)增大，72℃組、86℃組在90 s以后增長(zhǎng)趨于平緩。且同一熱療時(shí)間下，各組間腦水含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＞0.05)。腦水含量隨熱療持續(xù)時(shí)間增長(zhǎng)呈增加趨勢(shì)，90 s以后各組均增加較劇烈，130 s以后趨于平緩。因此認(rèn)為，(1)腦水腫的發(fā)生與熱療持續(xù)時(shí)間關(guān)系密切，而與溫度改變關(guān)系不大。(2)要獲得最佳熱療效果同時(shí)盡量減少腦水腫發(fā)生，建議提高熱療溫度而減少熱療持續(xù)時(shí)間。

射頻熱凝療法增加了腦轉(zhuǎn)移瘤和腦膠質(zhì)瘤治療的方法，該療法創(chuàng)傷小，療效確切。但是，射頻熱凝療法治療腦轉(zhuǎn)移瘤和腦膠質(zhì)瘤仍有并發(fā)腦水腫等許多不足之處，需要不斷總結(jié)經(jīng)驗(yàn)加以改進(jìn)。對(duì)此我們還將進(jìn)一步深入研究，以逐步探求人腦膠質(zhì)瘤及轉(zhuǎn)移瘤射頻熱凝的最佳作用溫度及作用時(shí)間。以便術(shù)者盡可能排除影響手術(shù)安全的因素，保證手術(shù)質(zhì)量，減少手術(shù)并發(fā)癥。

［1］ 周洪語，羅其中，沈建康.惡性腦腫瘤治療新進(jìn)展［J］.中華神經(jīng)外科雜志，2001，17(5):332-334.

［2］ 張智堅(jiān)，吳孟超，陳漢，等.經(jīng)皮肝穿刺射頻熱凝治療肝臟腫瘤［J］.中華外科雜志，2001，39(10):749-752.

［3］ Gerweck LE.Modification of cell lethality at elevated temperatures:the pH effect［J］.Radiat Res，1977，70(1):224-235.

［4］ 王東成，李廣玉，侯寬省，等.微創(chuàng)射頻熱凝治療腦轉(zhuǎn)移瘤和腦膠質(zhì)瘤6例分析［J］.臨床醫(yī)學(xué)，2004，24(11):34-35.