韓學(xué)東， 張學(xué)營， 甄林林， 張 建， 任 毅

腫瘤與正常組織在基因表達(dá)模式上存在明顯差 異，可以通過檢測腫瘤患者血液中腫瘤特異性信使RNA來進(jìn)行腫瘤診斷，因此血漿中某種特定的RNA分子作為腫瘤標(biāo)志物用于臨床診斷顯示了良好的應(yīng)用前景［1］。miR-155是最早被發(fā)現(xiàn)的具有促癌活性的微小RNA(miRNA)，不僅在乳腺癌內(nèi)表達(dá)增高，而且可以促進(jìn)體內(nèi)外乳腺癌細(xì)胞的增殖和生長。血漿和血清中也存在miR-155，其能夠?qū)购颂呛怂崦傅慕到舛３址€(wěn)定性，這表明血液循環(huán)中的miR-155有可能成為新一代的乳腺癌腫瘤標(biāo)志物，也有可能為乳腺癌發(fā)病機(jī)制及治療和預(yù)后判斷等研究提供一個新的方向［2］。但目前關(guān)于乳腺癌患者血液循環(huán)中miR-155的相關(guān)研究較少，本研究采用實(shí)時熒光定量PCR方法，檢測血清中miR-155的表達(dá)水平，分析其與乳腺癌臨床病理特征之間是否存在可靠的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 研究對象

收集2010年12月至2011年4月入院的67例女性患者為研究對象，其中乳腺癌患者45例，年齡29～68歲，中位年齡45歲;良性乳腺疾病患者22例，年齡27～63歲，中位年齡42歲(與乳腺癌組患者相比，具可比性)。所有乳腺癌患者均按WHO乳腺腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行病理學(xué)分型，其中浸潤性導(dǎo)管癌41例，浸潤性小葉癌4例;腫瘤≤2 cm(T1)18例，＞2 cm 27例(其中T2 20例，T3 7例);腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性24例，陰性21例;TNM分期Ⅰ、Ⅱ期28例，Ⅲ期17例;ER(+)20例，ER(－)25例;PR(+)24例，PR(－)21例。所有患者在采集血液標(biāo)本前均未經(jīng)手術(shù)，未經(jīng)放、化療，且無炎癥等合并癥。

1.2 研究方法

1.2.1 主要試劑 miRcute_miRNA提取分離試劑盒、miRcute_miRNA第一鏈合成試劑盒和miRcute_miRNA熒光定量檢測試劑盒購自北京TIANGEN公司，miR-155、miR-16、U6上游引物購自上海生工生物工程有限公司。

1.2.2 分離血清以及miRNA富集部分的提取 采集血液標(biāo)本后在15℃ ～20℃環(huán)境下靜置30 min，血液凝固后析出血清，吸取上清液離心10 min(5 000轉(zhuǎn)/min)，去除殘存血細(xì)胞，所得淡黃色血清即可用于實(shí)驗(yàn)。在采集血液標(biāo)本后2 h內(nèi)吸取200 μL離心后的血清，用miRcute_miRNA提取分離試劑盒進(jìn)行miRNA富集部分的提取，將提取出的miRNA保存于－70℃冰箱備用。

1.2.3 miRNA 的 cDNA 合成 應(yīng)用 miRcute_miRNA第一鏈合成試劑盒，嚴(yán)格按照說明進(jìn)行操作，吸取11 μL提取后的 miRNA液體，分兩步進(jìn)行cDNA合成。合成后的cDNA保存于－20℃冰箱備用。

1.2.4 miRNA的實(shí)時熒光定量檢測 采用 miR-cute_miRNA熒光定量檢測試劑盒，以miR-16和U6為內(nèi)參基因，用實(shí)時熒光定量PCR方法檢測miR-155在血清中的表達(dá)情況。miR-155、miR-16和U6的上游引物基因序列以及引物序列見表1。實(shí)時熒光定量PCR采用20 μL的反應(yīng)體系，每孔加入1.5 μL 的 cDNA，1.6 μL 2.5nM 的上游引物，0.4 μL 10 nM 的 Reserve Primer，10 μL miRcute_miRNA premix(含 SYBR，含 ROX)，6.5 μL 的 dd 水，每孔重復(fù) 3次。陰性對照中不加模板cDNA而以水代替，用于檢驗(yàn)是否存在 PCR污染。miR-155、miR-16和 U6的熒光定量標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

進(jìn)行實(shí)時定量PCR法檢測miRNA的相對表達(dá)量時，以miR-16和U6為內(nèi)參基因?qū)δ繕?biāo)基因進(jìn)行歸一化處理，確保在相等數(shù)量的樣品中比較目標(biāo)基因的量。血清中miRNA的表達(dá)水平計(jì)算公式如下:RQ=2－△CT，其中 RQ代表相對表達(dá)量(relative quantitation)，△CT=Ctargett－ Crefence，CTtarget、CTrefence表示某同一標(biāo)本中目的基因以及內(nèi)參基因的CT值;A組與B組間miRNA的表達(dá)水平變化使用RQ=2－△△CT計(jì)算，其中△△CT=(CTtarget－ CTrefence)A組－(CTtarget－CTrefence)B組。在進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析前，對計(jì)算所得miRNA的相對表達(dá)水平進(jìn)行對數(shù)轉(zhuǎn)換，轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布。不同病理特征各組間的比較采用成組t檢驗(yàn)方法，使用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

miR-155在乳腺癌與非乳腺癌患者血清中的表達(dá)有明顯差異，乳腺癌患者血清中miR-155表達(dá)水平比非乳腺癌患者上調(diào)18.155倍(P＜0.05)。在乳腺癌患者中，腫瘤大小為T1的血清miR-155表達(dá)水平相對于 T2和 T3患者下調(diào) 9.332倍(P＜0.05);腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性患者血清中miR-155表達(dá)水平比陰性者上調(diào)6.457倍(P＜0.05);Ⅰ、Ⅱ期患者血清miR-155的表達(dá)水平比Ⅲ期患者下調(diào)8.511倍(P＜0.05);與ER陰性患者相比，ER陽性患者血清中miR-155表達(dá)水平下調(diào)16.595倍(P＜0.05);與PR陰性患者相比，PR陽性患者血清中miR-155表達(dá)水平下調(diào)15.848倍(P＜0.05)。具體結(jié)果見表2、圖2～4。

表2 血清中miR-155表達(dá)水平與乳腺癌臨床病理特征之間的關(guān)系

圖2 乳腺癌與非乳腺癌患者、腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性與陰性者血清中miR-155表達(dá)水平的比較

圖3 乳腺癌Ⅰ、Ⅱ期與Ⅲ期，T1與T2、T3乳腺癌患者血清中miR-155表達(dá)水平的比較

圖4 ER、PR陽性與陰性患者血清中miR-155表達(dá)水平的比較

3 討論

微小RNA(miRNA)是一類長度為20～24個核苷酸的短序列、非編碼、單鏈小分子RNA，在胃腸癌、胰腺癌、前列腺癌等多種惡性腫瘤中都有表達(dá)，而且表達(dá)水平與組織病理學(xué)特征以及疾病的不同階段之間存在著密切關(guān)系［3-4］。一般認(rèn)為血液循環(huán)中的miRNA主要來源于凋亡或壞死的細(xì)胞、細(xì)胞的主動釋放以及循環(huán)細(xì)胞的裂解等。近來研究認(rèn)為血液循環(huán)中的miRNA是由腫瘤細(xì)胞選擇性分泌的［5］，這就說明循環(huán)中的miRNA可以用來作為腫瘤標(biāo)志物。miRNA和腫瘤的關(guān)系已成為腫瘤領(lǐng)域中新的研究熱點(diǎn)。

Iorio等［6］應(yīng)用微陣列芯片首次發(fā)現(xiàn)有29條miRNA在乳腺癌中表達(dá)失調(diào)，其中17條表達(dá)上調(diào)，miR-155是明顯上調(diào)的miRNA之一，提示其在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展過程中可能發(fā)揮了重要作用。Kong等［7］研究表明miR-155在NMuMG細(xì)胞中參與了上皮細(xì)胞的間質(zhì)化和浸潤，并且表明miR-155在乳腺癌的轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-155在乳腺癌患者血清中的表達(dá)水平明顯上調(diào)，而且與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀況以及腫瘤分期等密切相關(guān)，顯示了其作為促癌基因的功能，這與既往關(guān)于miR-155的研究結(jié)論是一致的，ER、PR陽性的乳腺癌患者預(yù)后往往好于陰性患者，我們推測，乳腺癌患者血清中miR-155表達(dá)水平上調(diào)也可能與乳腺癌的不良預(yù)后相關(guān)，還需要大樣本研究和長期隨訪才能證實(shí)。

本研究發(fā)現(xiàn)，miR-155在乳腺癌患者血清中表達(dá)水平上調(diào)，且與乳腺癌的臨床病理特征密切相關(guān)，主要與腫瘤大小、腫瘤分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等因素有關(guān)。血清中的miRNA有可能成為新一代的乳腺癌腫瘤標(biāo)志物，并可用于乳腺癌的臨床診斷和預(yù)后判斷，具有較好的臨床應(yīng)用前景。

［1］ Chan KC，Lo YM.Circulating tumour-derived nucleic acids in cancer patients:potential applications as tumour markers［J］.Br J Cancer，2007，96(5):681-685.

［2］ Zhao H，Shen J，Medico L，et al.A pilot study of circulating miRNAs as potential biomarkers of early stage breast cancer［J］.PLoS One，2010，5(10):e13735.

［3］ Brase JC，Johannes M，Schlomm T，et al.Circulating miRNAs are correlated with tumor progression in prostate cancer［J］.Int J Cancer，2011，128(3):608-616.

［4］ Guo HQ，Huang GL，Guo CC，et al.Diagnostic and prognostic value of circulating miR-221 for extranodal natural killer/T-cell lymphoma［J］.Dis Markers，2010，29(5):251-258.

［5］ Pigati L，Yaddanapudi SC，Iyengar R，et al.Selective release of microRNA species from normal and malignant mammary epithelial cells［J］.PLoS One，2010，5(10):e13515.

［6］ Iorio MV，F(xiàn)erracin M，Liu CG，et al.MicroRNA gene expression deregulation in human breast cancer［J］.Cancer Res，2005，65(16):7065-7070.

［7］ Kong W，Yang H，He L，et al.MicroRNA-155 is regulated by the transforming growth factor beta/Smad pathway and contributes to epithelial cell plasticity by targeting RhoA［J］.Mol Cell Biol，2008，28(22):6773-6784.