帥 明 林荔軍 林昭偉 劉云龍 李 奇 (南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院骨科，廣東 廣州 510282)

骨性關(guān)節(jié)炎(OA)是中年以上人群中最常見的疾病之一，并且患病人數(shù)隨著年齡的增加逐步增多〔1〕。近年來，生物因素尤其是軟骨及滑液代謝介質(zhì)的研究越來越受到重視〔2〕。本研究探討OA滑膜中的白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)的表達(dá)與 OA發(fā)病的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性新西蘭大白兔30只，月齡6個(gè)月，體重(2 000±500)g，由南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物研究中心提供(許可證號(hào)SCXK粵2011-0015)。

1.2 儀器及試劑 木瓜蛋白酶購(gòu)自天津市諾奧科技發(fā)展有限公司，活力200萬(wàn)單位/g。IL-1β與VEGF ELISA試劑盒 (ADL公司，San Diego，USA);鼠抗 HIF-1α 多克隆抗體(Santa Cruz，USA)，山羊抗兔 IgG(H+L)/辣根過氧化物酶(HRP，Jackson，USA)。電泳儀(G42，Biometra，Germany)，標(biāo)準(zhǔn)電源箱(P25，Biometra，Germany)。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物分組 健康雄性新西蘭大白兔30只，復(fù)合飼料喂養(yǎng)(飼料由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，飼養(yǎng)溫度20℃ ～25℃，濕度65%，適應(yīng)喂養(yǎng)1 w后將30只兔隨機(jī)數(shù)字表法分為6 組，A1、A2、A3 為模型組、B1、B2、B3 為對(duì)照組，每組5 只。

1.3.2 模型建立 參照 Muehleman等〔3〕方法，分別于第1、4、7日使用苯巴比妥1 ml/kg體重對(duì)兔行耳緣靜脈注射進(jìn)行麻醉，麻醉后于兔膝關(guān)節(jié)周圍剃毛，碘伏消毒，關(guān)節(jié)輕度彎曲于髕腱兩側(cè)進(jìn)針，A1、A2、A3組注入1.6%木瓜蛋白酶溶液0.5 ml，B1、B2、B3組注入同等劑量的生理鹽水溶液。

1.3.3 標(biāo)本采集及處理 分別于造模完成后2、4、6 w用氣栓法處死A1和B1，A2和B2，A3和B3組兔子，逐層切開膝關(guān)節(jié)，觀察標(biāo)本滑膜、軟骨的大體形態(tài)，切取關(guān)節(jié)滑膜，使用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗，液氮保存，待整組滑膜都切取結(jié)束后，置入-80℃冰箱中保存。

1.3.4 酶聯(lián)免疫法測(cè)VEGF和IL-1β的含量 切割標(biāo)本后，稱取重量。手工或勻漿器將標(biāo)本充分勻漿。離心20 min(2 000～3 000 r/min)，收集上清。嚴(yán)格按照說明書操作。以空白孔調(diào)零，450 nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度(OD值)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出待測(cè)標(biāo)本VEGF、IL-1β含量(ng/L)。

1.3.5 Western印跡測(cè)定HIF-1α的含量 0.1 g組織加0.3 ml裂解液(每毫升裂解液加入5 μl PMSF)4℃裂解1 h。4℃12 000 r/min離心20 min，取上清。加入上樣緩沖液，100℃加熱5 min使蛋白變性。每孔上樣8 μl總蛋白，15%十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯凝膠電泳2 h(濃縮膠電壓80 V，分離膠120 V)。電泳結(jié)束后用半干轉(zhuǎn)移系統(tǒng)將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上(80 mA，30 min)。室溫下用含50 g/L牛血清白蛋白(BSA)的Tris鹽酸緩沖液(TBST)封閉2 h，然后分別加入一抗:HIF-1α(1∶500)，4℃過夜。再分別加入相應(yīng)二抗，室溫孵育1 h。增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(ECL)發(fā)光試劑盒顯影，以β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)為內(nèi)參，用Image-Pro軟件分析條帶吸光值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)資料以±s表示，采用單因素方差分析，各組之間采用多重比較LSD或Dunnett多重比較法。

2 結(jié)果

2.1 大體觀察 B1、B2、B3組兔膝關(guān)節(jié)無(wú)腫脹、充血，關(guān)節(jié)液透明，滑膜無(wú)水腫、肥厚，關(guān)節(jié)軟骨呈淡藍(lán)色、半透明光滑;A1、A2、A3組兔膝關(guān)節(jié)腫脹、充血明顯，關(guān)節(jié)液呈淡黃色渾濁狀態(tài)。B1組滑膜稍增厚，軟骨未見缺損，關(guān)節(jié)面粗糙有小的裂隙且色澤灰暗。B3組滑膜明顯增厚關(guān)節(jié)面軟骨色澤灰暗、潰瘍形成。A3組滑膜最厚，與股骨粘連嚴(yán)重，軟骨缺損明顯，部分軟骨剝脫，軟骨下骨質(zhì)暴露。

2.2 滑膜的IL-1β和VEGF的表達(dá) IL-1β、VEGF的表達(dá)，A1組＞B1組、A2組＞B2組、A3組＞B3組(均P＜0.05)，模型組中A1組＜A2組、A2組＜A3組(均P＜0.05)。說明IL-1β和VEGF表達(dá)隨模型時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。見表1。

表1 各組滑膜的IL-1β和VEGF的表達(dá)(± s，n=5，ng/L)

表1 各組滑膜的IL-1β和VEGF的表達(dá)(± s，n=5，ng/L)

與A1組比較:1)P＜0.05;與A2組比較:2)P＜0.05;與A3組比較:3)P＜0.05

組別 IL-1βVEGF A1 31.467 3±1.950 0 185.796 6±5.950 1 A2 42.976 3±1.340 11) 208.918 6±5.384 51)A3 47.548 4±1.597 51)2) 246.122 5±6.550 51)2)B1 18.070 0±0.871 21) 141.271 7±5.048 71)B2 18.368 7±0.749 02) 144.652 1±3.568 72)B3 20.131 6±1.060 93) 142.237 5±6.491 23)

2.3 Western印跡測(cè)定滑膜中HIF-1α的含量 模型組滑膜中的HIF-1α的含量均高于對(duì)照組，A1組〔(0.80±0.05)ng/L〕＞B1組〔(0.40±0.02)ng/L〕、A2組〔(1.08±0.06)ng/L〕＞B2組〔(0.51±0.03)ng/L〕、A3組〔(1.26±0.08)ng/L〕＞B3組〔(0.61±0.03)ng/L〕(均P＜0.01)，且隨模型時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。A1組＜A2組，A2組＜A3組(均P＜0.05)。見圖1。

圖1 Western印跡檢測(cè)滑膜中HIF-1α蛋白的表達(dá)

3 討論

OA動(dòng)物模型的建立有多種方法，如手術(shù)、關(guān)節(jié)制動(dòng)、藥物注射及自發(fā)模型等，其中以藥物注射方法較常用，多采用木瓜蛋白酶注射方式進(jìn)行誘導(dǎo)。相關(guān)研究表明，將木瓜蛋白酶注入兔、豚鼠的髖關(guān)節(jié)或膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)可引發(fā)迅速進(jìn)展的 OA〔4～7〕。木瓜蛋白酶可分解軟骨基質(zhì)中的蛋白多糖，促使其從軟骨中丟失，而OA患者軟骨早期發(fā)生的最顯著變化就是水分增加及蛋白多糖減少，故木瓜蛋白酶誘發(fā)的OA模型與人體OA類似，是研究OA的較佳造模方法。

由于雌激素對(duì)實(shí)驗(yàn)兔OA的發(fā)生、發(fā)展均有影響〔7〕，故本研究全部選用雄兔進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以盡可能消除雌激素對(duì)結(jié)果產(chǎn)生的干擾。本實(shí)驗(yàn)復(fù)制的兔膝關(guān)節(jié)OA模型表現(xiàn)與OA的病理形態(tài)學(xué)變化一致，說明模型復(fù)制成功且A1、A2、A3組病理程度逐漸加重。而模型組OA病理進(jìn)展過程中滑膜中的IL-1β、HIF-1α、VEGF的表達(dá)較對(duì)照組明顯增高且呈逐漸升高趨勢(shì)，因此可以認(rèn)為IL-1β、HIF-1α、VEGF過度表達(dá)可能是導(dǎo)致病理過程進(jìn)展的因素。

其可能機(jī)制包括:①IL-1β對(duì)OA的影響:首先表現(xiàn)為對(duì)軟骨細(xì)胞的影響，高水平IL-1β與軟骨細(xì)胞膜上受體結(jié)合將導(dǎo)致復(fù)合物增加，進(jìn)而抑制軟骨細(xì)胞合成蛋白多糖、Ⅱ型膠原及細(xì)胞增殖，加快軟骨細(xì)胞變性而分泌Ⅰ、Ⅲ型膠原。促進(jìn)軟骨細(xì)胞分泌基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)、一氧化氮合成酶，調(diào)控軟骨細(xì)胞凋亡;其次表現(xiàn)為對(duì)關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)的影響，IL-1β導(dǎo)致軟骨基質(zhì)的主要成分膠原蛋白和蛋白多糖合成受阻，另一方面對(duì)基質(zhì)蛋白多糖的消化增加，并由此引發(fā)基質(zhì)水分喪失，軟骨細(xì)胞不能從基質(zhì)中獲得充分營(yíng)養(yǎng)，自身功能受損，出現(xiàn)基質(zhì)形態(tài)與軟骨細(xì)胞功能間的惡性循環(huán);并且IL-1β對(duì)軟骨細(xì)胞具有旁分泌和自分泌作用，能進(jìn)一步促進(jìn)OA病程迅速發(fā)展。②HIF-1α的影響。在常氧條件下HIF-1α經(jīng)蛋白酶體降解，這種酶解呈氧依賴性，因此缺氧狀態(tài)下HIF-1α的降解受阻并最終易位到細(xì)胞核與HIF-1β二聚化，組成有活性的HIF-1，調(diào)節(jié)多種靶基因-缺氧反應(yīng)基因，如 VEGF、EPO 等的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)〔8，9〕。Yudoh等〔10〕發(fā)現(xiàn)代謝壓力和氧壓力都可以誘導(dǎo)OA患者關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中HIF-1α基因的表達(dá)，HIF-1α mRNA在衰退區(qū)域的表達(dá)比未衰退區(qū)域增多，缺乏HIF-1α基因的軟骨細(xì)胞無(wú)論在常氧和缺氧條件下均不能產(chǎn)生能量和合成基質(zhì)，并且代謝應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡加快。③新生血管的形成是關(guān)節(jié)破壞發(fā)生發(fā)展的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，新生血管的大量形成和滑膜的不斷增生逐漸形成具有侵襲性的血管翳，使得關(guān)節(jié)侵襲受損而致殘。VEGF是目前發(fā)現(xiàn)的促進(jìn)血管生成的最重要因子，能特異地結(jié)合血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)，增加血管通透性，從而促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)，增加血管通透性，從而促進(jìn)血管生成〔11，12〕，其表達(dá)主要受HIF-1α 調(diào)控〔13〕。

本實(shí)驗(yàn)提示IL-1β能抑制軟骨細(xì)胞合成蛋白聚糖及細(xì)胞增殖。IL-1β表達(dá)上升的同時(shí)伴隨著HIF-1α表達(dá)增高，即IL-1β可以誘導(dǎo)和刺激關(guān)節(jié)軟骨中的HIF-1α的表達(dá)。而VEGF與OA密切相關(guān)，VEGF可以在骨關(guān)節(jié)炎軟骨中表達(dá)，隨著OA嚴(yán)重程度增強(qiáng)而增多，并且在骨關(guān)節(jié)炎的進(jìn)程中受到HIF-1α基因的調(diào)控。HIF-1α可以誘導(dǎo)OA中VEGF的表達(dá)，調(diào)節(jié)VEGF對(duì)組織缺氧的反應(yīng)，表現(xiàn)為VEGF表達(dá)亦增高，說明了IL-1β、HIF-1α、VEGF與OA的相關(guān)性。

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