杜 文 王 謙 王佳堃 劉建新

(浙江大學奶業(yè)科學研究所，動物分子營養(yǎng)學教育部重點實驗室，杭州 310058)

木聚糖是D-木糖通過β-1，4-木糖苷鍵連接而成的一種多聚五碳糖，是植物細胞壁中常見的半纖維素多糖，占植物碳水化合物總量的1/3，含量僅次于纖維素，是自然界中第2豐富的可利用資源［1］。在飼料工業(yè)中，由于單胃動物缺少降解半纖維素的酶，因此木聚糖對單胃動物幾乎沒有營養(yǎng)作用，而且沒有消化的纖維物質(zhì)會增加食物的黏性，干擾消化酶的作用及營養(yǎng)的吸收［2］;反芻動物由于瘤胃微生物的存在，對木聚糖具有一定的降解能力［3］，但是，實際生產(chǎn)中仍需要補充外源酶制劑，進一步提高其對粗飼料的消化率［4-5］。木聚糖酶是能專一水解木聚糖為主體的低聚木糖和D-木糖的一類糖苷水解酶的總稱［6］，主要包括:β -D-1，4- 內(nèi)切木聚糖酶(endo-1，4-β-D-xylanxylanohydrolase，E.C.3.2.1.8)、β -木糖苷酶(β-xylosidase，E.C.3.2.1.37)和 β -1，4- 外切木聚糖酶(E.C.3.2.1.7)。木聚糖酶在天然材料中基因表達水平低、活性差、生產(chǎn)成本高，嚴重限制了它的推廣應用［5］。為了滿足飼用酶制劑的生產(chǎn)需要、開發(fā)半纖維類生物能源，利用體外定向進化技術(shù)改良木聚糖酶基因，提高木聚糖酶的催化活性和熱穩(wěn)定性，以獲得高活性高產(chǎn)量的木聚糖酶就成了目前研究的熱點。

1 木聚糖酶基因的來源

自1983年Bernier等［7］從枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)中分離得到木聚糖酶基因，到目前為止，國內(nèi)外已報道了300余種不同菌株來源的木聚糖酶基因，其中近百種基因被克隆和表達在合適的宿主中［2，8］。不同來源的木聚糖酶，酶學性質(zhì)差別較大(表1)［9-25］。細菌木聚糖酶的分子質(zhì)量在22.5～60.0 ku，最適溫度范圍為40～75℃，最適pH范圍為6.0～8.0，其中以7.0居多;熱穩(wěn)定性在40℃附近較好，pH穩(wěn)定性范圍為4.5～11.0，主要集中于6.0～9.0。一些放線菌也能產(chǎn)生木聚糖酶，如橄欖綠鏈霉菌A1(Streptomyces olivaceoviridis A1)［15］和耐鹽高溫雙歧菌YIM 90462T(Thermobifida halotolerans YIM 90462T)［16］，其酶分子質(zhì)量分別為20.8和34.0ku，最適溫度分別為60和90℃，最適pH分別為5.2和9.0;熱穩(wěn)定性在60℃附近較好，pH穩(wěn)定性范圍分別為4.0～8.8和7.0～8.0。真菌木聚糖酶的酶分子質(zhì)量在20.0～31.6 ku，最適溫度主要集中于50℃(50～65℃)，最適pH范圍為3.0～6.0;熱穩(wěn)定性范圍為40～60℃，平均在50℃左右，pH穩(wěn)定性范圍為2.5～10.0，主要集中于3.5～7.5。在木聚糖酶產(chǎn)量方面，真菌與細菌相比具有明顯的優(yōu)勢［26］;各類產(chǎn)木聚糖酶微生物里都有木聚糖酶活性較高的代表，如細菌里的中度嗜鹽菌 AX2000(Bacillus alcalophilus AX2000)［12］，它產(chǎn)生的木聚糖酶活性高達25 000 U/mg;放線菌里的橄欖綠鏈霉菌 A1［15］，它產(chǎn)生的木聚糖酶活性高達15 000 U/mL;真菌里的青霉菌 Pol6(Penicillium occitanis Pol6)［23］和黑曲霉BCC14405(Aspergillus niger BCC14405)［21］，它們產(chǎn)生的木聚糖酶活性分別為8 549.85和8 007 U/mg。

2 宏基因組學在木聚糖酶基因開發(fā)上的應用

隨著分子生物學技術(shù)的發(fā)展，越來越多的產(chǎn)木聚糖酶微生物被發(fā)現(xiàn)，然而環(huán)境中還有很多微生物資源不能通過純培養(yǎng)技術(shù)分離得到，近年來發(fā)展起來的宏基因組技術(shù)解決了這一難題，它通過免培養(yǎng)技術(shù)，研究生境中全部微生物遺傳物質(zhì)的總和，挖掘未培養(yǎng)微生物的基因資源［27］，在木聚糖酶基因的開發(fā)上顯示出了巨大的潛力。表2［28-37］列舉了 2008—2013 年間以環(huán)境樣本構(gòu)建宏基因組文庫篩選到的木聚糖酶，樣品來源于反芻動物瘤胃［29，31-32，34-36］、土壤［28，33，37］和堆肥［30，37］，其中以反芻動物瘤胃居多。常用的文庫載體是質(zhì)粒BAC［29，32］和FOS［30，33-36］，宿主是大腸桿菌［28-31，32-37］。文庫平均插入片段 在5.5 ～54.5 kb之間，篩選到的克隆數(shù)大都在10 000以上，木聚糖酶陽性率最高可達0.14%。

3 木聚糖酶基因的體外定向進化

蛋白質(zhì)工程技術(shù)，包含蛋白質(zhì)的理性設(shè)計和非理性設(shè)計2種方法。傳統(tǒng)的理性設(shè)計需要預先知道蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、活性位點、催化機制等信息，在清楚結(jié)構(gòu)與功能的前提下，定點突變改變蛋白質(zhì)分子中個別氨基酸殘基，產(chǎn)生新性狀的蛋白質(zhì)［38］。然而，在實際應用中，蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)信息很難獲取，結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系異常復雜，因此理性設(shè)計具有很強的限制性［39］。蛋白質(zhì)的非理性設(shè)計，即體外定向進化，它模擬達爾文的自然進化論，利用基因的突變和重組，從體外改造酶的基因，產(chǎn)生基因多樣性，并結(jié)合定向的篩選最終獲得預期性質(zhì)的進化酶，因它不需要預先知道蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)信息，彌補了理性設(shè)計的不足［40］。它主要包括突變文庫的構(gòu)建、功能表達和文庫篩選(選擇)3個步驟［41］，其核心是突變文庫的構(gòu)建和文庫篩選(圖1)。

3.1 木聚糖酶基因突變文庫的構(gòu)建

突變文庫的庫容及多樣性是酶分子體外定向進化的基礎(chǔ)。構(gòu)建突變文庫的方法有很多，如易錯PCR(error-prone PCR)、DNA重排(DNA shuffling)，以及基于DNA重排的原理，圍繞基因片段重組這一思想產(chǎn)生的交錯延伸法(staggered extension process，StEP)、隨機引物體外重組(randompriming in vitro recombination，RPR)、退火低核苷酸基因重排(degenerate oligonucleotide gene shuffling，DOGS)、外顯子重組(exon shuffling)、酵母增強組合文庫(combinatorial libraries enhanced by recombination in yeast，CLERY)、隨機片段交換法(random insertional-deletional strand exchange mutagenesis，RAISE)等［38，40］，常用的是易錯PCR和DNA 重排(表 3)［43-50］。

易錯PCR是定向進化最早采用的一種建庫方法，由 Leung 等［51］提出，后經(jīng) Cadwell等［52］改良，其原理是在體外擴增目的基因時改變PCR的條件，使堿基產(chǎn)生錯配，導致目的基因隨機突變。Stephens等［43］用易錯PCR產(chǎn)生基因突變，改良1個來自疏棉狀嗜熱絲孢菌(Thermomyces lanuginosus)的耐熱木聚糖酶基因XynA，以提高木聚糖酶熱穩(wěn)定性，其最優(yōu)突變體酶2B7-10發(fā)生1處點突變(Y58F)，該突變使其在80℃孵育60 min還能保持71%的活性，遠高于親本酶XynA。McHunu等［44］利用易錯PCR提高另一個來自疏棉狀嗜熱絲孢菌(Thermomyces lanuginosus)的木聚糖酶的耐堿性，其突變體酶在60℃，pH 10.0的堿性條件下孵育60 min，還能保持84%的活性，而親本酶同樣處理后僅剩22%的活性。Wang等［45］利用易錯PCR提高1株雜合木聚糖酶ATx的催化活性，1處氨基酸替換(L49P)使突變體酶的催化活性提高。易錯PCR的原理簡單，操作簡便，對親本基因的限制條件不多，而且可以和其他突變方法結(jié)合使用，因此應用十分廣泛，但該方法屬于無性突變，遺傳只發(fā)生在單一分子內(nèi)部，一般適用于較小的基因片段(＜800 bp)［40］。

表2 利用宏基因組文庫篩選到的木聚糖酶Table 2 Xylanases screening from the metagenomic library

隨著人們對酶的進化期望越來越大，定向進化技術(shù)也在不斷的成熟和發(fā)展。1994年，Stemmer［53-54］提出 DNA 重排(DNA shuffling)并成功運用，為體外定向進化技術(shù)的飛躍做出了巨大貢獻。其原理是用脫氧核糖核酸酶Ⅰ(DNaseⅠ)切割一組含有不同點突變的基因片段，產(chǎn)生不同大小的隨機片段，這些片段再經(jīng)重新組合、擴增形成全長的基因，實現(xiàn)不同基因片段的重組。其優(yōu)勢是可以有效積累有益突變，排除有害和中性突變，同時也能實現(xiàn)蛋白質(zhì)多種特性的共進化［55］。在木聚糖酶基因定向進化研究上，也有不少應用該技術(shù)的例子。Xia等［46］利用DNA重排改良1個來自變鉛青鏈霉菌(Streptomyces lividans)的木聚糖酶B的熱穩(wěn)定性和耐堿性，得到的最優(yōu)突變體酶在70℃可以維持活性時長達6 h，而親本酶處理3 min后就喪失了50%的活性，此外，突變體酶在pH 9.0的條件下穩(wěn)定性增加，這些都顯示了突變體酶在熱穩(wěn)定性和耐堿性上的極大優(yōu)勢。

DNA重排的前提是存在1組含有不同點突變的基因片段，因而常將DNA重排和易錯PCR等進化方法結(jié)合使用。Miyazaki等［47］將易錯 PCR、飽和誘變、DNA重排3種方法結(jié)合改良1個來自枯草芽孢桿菌的木聚糖酶的熱穩(wěn)定性，最終得到1個含有3個氨基酸替換的優(yōu)勢突變體Xylst，該突變使其熱穩(wěn)定性顯著增加，在60℃條件下，突變體酶活性可維持2 h，然而親本型5 min內(nèi)就失去了活性。Zhang等［48］利用易錯PCR和基于DNA重排的家族重排(family shuffling)技術(shù)，與蛋白質(zhì)半理性設(shè)計相結(jié)合改良1個來源于嗜熱脂肪芽孢桿菌(Geobacillus stearothermophilus)的木聚糖酶XT6的熱穩(wěn)定性，穩(wěn)定性最佳的突變體酶含有13個氨基酸的替換，該替換導致其半衰期是親本型的52倍，最適溫度從77℃上升至87℃，催化效率提高90%。

圖1 酶定向進化的突變文庫構(gòu)建(A)和高通量文庫篩選(B)策略Fig.1 Strategies for the directed evolution of enzymes involving generation of variant gene libraries(A)and high-throughput screening of libraries(B)［42］

表3 定向進化技術(shù)成功改良的微生物木聚糖酶Table 3 Successfully optimized microbial xylanases by directed evolution

續(xù)表3

3.2 突變文庫篩選

木聚糖酶基因突變文庫構(gòu)建之后，確定一個高通量、高選擇性、高靈敏度的篩選方法是快速成功地從龐大的突變庫中篩選到目的產(chǎn)物的重要保證［56］。目前常用的篩選方法有平板篩選和基于熒光或顯色反應的篩選2種。其中平板篩選最為簡便，針對木聚糖酶的平板篩選有RBB-xylan法和剛果紅染色法，它是基于木聚糖酶的催化活性和底物分解前后性質(zhì)的改變，在固體平板中加入木聚糖底物，將克隆點種在相應的選擇平板上，宿主菌表達木聚糖酶水解木聚糖形成透明圈，根據(jù)透明圈的有無、大小，初步確定是否陽性克隆或優(yōu)勢突變體。但這種篩選局限于底物特異性、酶活性等突變方向的篩選，并且在篩選酶活高的突變體時，也只能作為初步的篩選。對于酶的最適pH、最適溫度、穩(wěn)定性等突變方向，仍需要以可測定的酶促反應結(jié)果來篩選，即基于熒光或顯色反應的方法，該方法也用于復篩酶活提高的突變體，常用的如3，5-二硝基水楊酸(3，5-dinitrosalicylic acid，DNS)法，它的原理是DNS與木聚糖酶水解木聚糖后產(chǎn)生的還原糖發(fā)生氧化還原反應，產(chǎn)物在煮沸條件下顯棕紅色，且在一定范圍內(nèi)顏色深淺與還原糖含量成比例關(guān)系，利用比色法測定還原糖含量，以達到篩選突變體的目的。該方法需要結(jié)合96孔板、酶標儀等設(shè)備以提高篩選效率［57］。

4 小結(jié)

不同生物來源的木聚糖酶，其酶學性質(zhì)差別較大，各類產(chǎn)木聚糖酶微生物里都有酶活較高的代表。宏基因組技術(shù)在開發(fā)環(huán)境木聚糖酶基因上顯示了巨大的潛力。隨著體外定向進化技術(shù)的進一步發(fā)展和完善，酶的突變、重組、篩選等過程進一步改進，木聚糖酶基因的改良將得到更快的發(fā)展。宏基因組技術(shù)和體外定向進化技術(shù)相結(jié)合必將加速木聚糖酶基因的開發(fā)和產(chǎn)業(yè)化應用，推動半纖維類生物能源的利用。

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