李曉敏 劉紅賓 咼于明 王 忠

(中國農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院，動物營養(yǎng)學國家重點實驗室，北京 100193)

腸道上皮細胞(intestinal epithelial cells，IECs)是腸道黏膜屏障的重要組成部分，除參與水分和營養(yǎng)物質(zhì)消化和吸收外，也參與宿主腸道黏膜固有免疫［1］。腸道上皮細胞受到食源性腸道致病菌，如沙門氏菌、致病性大腸桿菌侵襲后，可表現(xiàn)免疫炎癥反應(yīng)，產(chǎn)生不同類型細胞因子，進而影響宿主腸道黏膜屏障結(jié)構(gòu)完整性和通透性［2-3］。

沙門氏菌病是主要人畜共患病，也是主要的食源性疾病之一。沙門氏菌血清型較多，目前發(fā)現(xiàn)2 000多種，傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium，ST)和腸炎沙門氏菌(Salmonella enteritidis，SE)是2種侵襲性強且具有廣泛感染宿主的血清型。畜禽是它們重要的感染宿主和貯存宿主，腸道是沙門氏菌入侵的主要靶器官［4］。沙門氏菌可通過編碼在沙門氏菌毒力島Ⅰ上的Ⅲ型分泌系統(tǒng)介導進入腸上皮細胞，該系統(tǒng)分泌的SPI(Salmonella pathogenic island)蛋白能夠與腸上皮細胞相互作用，從而觸發(fā)一系列反應(yīng)，包括產(chǎn)生促炎性細胞因子，導致局部多形核細胞匯集和大量液體滲出［5-6］。沙門氏菌嚴重感染時，黏附在腸道黏膜上的沙門氏菌可破壞腸道上皮細胞屏障結(jié)構(gòu)，通過腸道上皮細胞，進入淋巴和血液循環(huán)，最終進入肝臟和脾臟，從而造成人或動物表現(xiàn)多種臨床癥狀，如發(fā)燒、胃腸炎、腹瀉、敗血癥和死亡，間接污染畜產(chǎn)品。耐過的動物可表現(xiàn)持續(xù)性感染和終身帶菌，成為主要傳染源。因此控制沙門氏菌感染，確保畜禽產(chǎn)品微生物安全，已成為動物生產(chǎn)的重要任務(wù)之一［4，7］。

抗生素在預(yù)防和治療沙門氏菌病中發(fā)揮了巨大作用，然而抗生素的使用也帶來了藥物殘留、抗藥性菌株出現(xiàn)等問題，因此尋找和開發(fā)預(yù)防和治療沙門氏菌病的抗生素替代物已成為當前控制沙門氏菌病、確保公共衛(wèi)生安全的主要任務(wù)。近幾年，國內(nèi)外很多研究表明通過營養(yǎng)性添加劑和具有免疫調(diào)節(jié)作用的非營養(yǎng)性添加劑，如益生菌、益生元、生物活性多糖等手段，來調(diào)控宿主非特異性和特異性免疫功能，調(diào)節(jié)宿主體內(nèi)促炎癥細胞或信號分子和抗炎癥細胞或信號分子的平衡等途徑來緩解免疫應(yīng)激或部分清除病原微生物，如沙門氏菌、致病性大腸桿菌感染，保護腸道黏膜屏障結(jié)構(gòu)完整和功能正常，已成為促進動物健康、減少抗生素使用和確保動物性食品安全生產(chǎn)的主要途徑之一［8-9］。β -1，3/1，6- 葡聚糖是一種結(jié)構(gòu)復(fù)雜的葡萄糖多聚復(fù)合物，普遍存在于細菌、酵母、蘑菇、谷類和海藻等的細胞壁中。體內(nèi)和體外試驗已經(jīng)表明，不同來源的β-1，3/1，6-葡聚糖可增強宿主先天性免疫和獲得性免疫功能，增強抗病原細菌、病毒和寄生蟲感染的能力，是極具生物活性的免疫增強劑［10］。Sophy 公司的β -1，3/1，6-葡聚糖又可稱為“黑酵母菌培養(yǎng)液”，它是將短梗霉菌屬的APF-202菌置于培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)后，經(jīng)過濾和熱處理(殺死活菌、停止發(fā)酵)所得的“一體化”培養(yǎng)液，是具有很高生理活性的水溶性胞外葡聚糖，并且現(xiàn)在已經(jīng)能夠作為健康食品添加劑應(yīng)用于市場。這種β-葡聚糖的結(jié)構(gòu)與香菇多糖或裂褶多糖的結(jié)構(gòu)極為相似，張亞茹等［11］研究發(fā)現(xiàn)，該β-1，3/1，6-葡聚糖可能通過促進細胞免疫和體液免疫的功能明顯抑制S180腹水移植瘤的生長。Ikewaki等［12］采用黑酵母 β-葡聚糖外培養(yǎng)外周血單核細胞(PMBC)，發(fā)現(xiàn)其可誘導白細胞介素 -8(IL-8)的產(chǎn)生增加。Yatawara等［13］發(fā)現(xiàn)黑酵母β-葡聚糖作為免疫調(diào)節(jié)劑，通過提高巨噬細胞及自然殺傷細胞(NK細胞)的活性，對黑熱病病原體亞馬遜利什曼原蟲(L.amazonensis)發(fā)揮噬菌作用。

然而，關(guān)于腸道致病菌感染情況下，黑酵母β-葡聚糖與腸道上皮細胞之間的相互作用機制尚未見報道。為此，本試驗以腸上皮細胞Caco-2細胞為模型，旨在探討當腸上皮細胞受到腸炎沙門氏菌感染后，黑酵母β-1，3/1，6-葡聚糖對腸上皮細胞炎癥和抗炎癥細胞因子的調(diào)節(jié)作用，以期進一步揭示其抗感染機制。

1 材料與方法

1.1 材料

黑酵母β-1，3/1，6-葡聚糖來自日本索菲公司(Sophy Inc)，相對分子質(zhì)量在10萬～50萬，易溶于水。產(chǎn)品菌株和細胞系:腸炎沙門氏菌菌株(Salmonella enteritidis sterotype，ATCC13076)購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所;人結(jié)腸癌細胞系Caco-2細胞購自北京銀紫晶生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司。

主要試劑:最低基本培養(yǎng)液(minimum essential medium，MEM)、青鏈霉素、胰蛋白酶、乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)消化液和磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)購自中科邁晨(北京)科技有限公司。胎牛血清(FBS)購自Gbico公司。12孔細胞培養(yǎng)板購自美國 Corning公司。溶菌肉湯(Luria-Bertani，LB)培養(yǎng)液購自北京益德益華科技發(fā)展有限公司。RNeasy Mini Kit購于QIAGEN公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒采用MBI Fermentas公司的Revert AidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit，實時熒光定量PCR試劑盒為TaKaRa公司生產(chǎn)的SYBR Premix EX TaqTMⅡ(Perfect Real Time)。

1.2 Caco-2細胞培養(yǎng)

Caco-2細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)液為含有10%FBS、200 U/mL青霉素、200μg/mL鏈霉素和50μg/mL兩性霉素的MEM，容器為75 cm2卡氏培養(yǎng)瓶，將其置于37℃培養(yǎng)箱中，通入5%CO2(相對濕度90%)。2 d換1次培養(yǎng)液，每5 d按1∶3的比例傳代，試驗所用細胞在10代以內(nèi)。

1.3 細菌培養(yǎng)和計數(shù)

腸炎沙門氏菌在LB培養(yǎng)液中37℃搖床培養(yǎng)24 h，在650 nm下測定菌懸液的OD值(當OD值為0.90時，菌液濃度為 5×108CFU/mL)，4 000 r/min離心15 min，用PBS洗2次，用不含血清和抗生素的MEM懸浮細菌，根據(jù)上述OD值調(diào)整菌液濃度為1×1010CFU/mL，同時用LB瓊脂進行平板計數(shù)以確定菌液濃度。

1.4 β-1，3/1，6-葡聚糖和腸炎沙門氏菌共培養(yǎng)

將貼壁生長良好的Caco-2細胞(細胞融合度達到90%以上)用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液消化處理，細胞計數(shù)，然后以5×104個/孔接種到12孔細胞培養(yǎng)板上，細胞培養(yǎng)液為2 mL/孔含10%FBS但不含抗生素的MEM，待細胞達到90%融合時(此時細胞濃度約為1×106個/mL)開始進行分組試驗。

試驗分成4個組，分別為對照組、腸炎沙門氏菌感染組、β -1，3/1，6-葡聚糖組、β -1，3/1，6-葡聚糖+腸炎沙門氏菌共培養(yǎng)組。每個處理3個重復(fù)，每孔為1個重復(fù)。Caco-2細胞培養(yǎng)3～5 d(中間每隔1 d換1次不含抗生素只含10%FBS的 MEM)，待細胞長成單層后，β -1，3/1，6-葡聚糖組和β-1，3/1，6-葡聚糖組+腸炎沙門氏菌共培養(yǎng)組各孔，棄去舊培養(yǎng)液，加入用不含抗生素只含10%FBS的MEM稀釋的終濃度為40μg/mL的黑酵母 β-1，3/1，6-葡聚糖溶液(原濃度為50μg/mL)。而培養(yǎng)基對照組和腸炎沙門氏菌感染組各孔仍換成新鮮的不含抗生素只含10%FBS的MEM。β-1，3/1，6-葡聚糖組預(yù)處理細胞24 h，腸炎沙門氏菌感染組和 β-1，3/1，6-葡聚糖+腸炎沙門氏菌共培養(yǎng)組分別加入20μL預(yù)先備好的腸炎沙門氏菌菌液，使最終濃度在1×108CFU/mL(細菌與細胞比例為100∶1)，其余2組加入同體積MEM，處理3 h，收集細胞提取總RNA。

1.5 總RNA提取和反轉(zhuǎn)錄

采用 RNeasy Mini Kit(Qiagen，USA)提取細胞總RNA，采用核酸蛋白測定儀于260和280 nm處檢測RNA的濃度和純度。cDNA合成按照Revert AidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit操作說明進行，反應(yīng)結(jié)束后-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 實時熒光定量PCR擴增

以β-肌動蛋白(β-actin)為內(nèi)參，進行實時熒光定量PCR，實時熒光定量PCR引物見表1(所有引物由上海生物工程公司設(shè)計和合成)。實時熒光定量 PCR采用 SYBR GreenⅠ染料法，按照SYBR Premix EX TaqTMⅡ(TaKaRa公司)操作說明書在ABI 7500 real-time PCR儀進行擴增。20μL反應(yīng)總體系:cDNA 2μL，上、下游引物各0.8μL(工作濃度為10μmol/L)，焦碳酸二乙酯(diethylpyrocarbonate，DEPC)水 6 μL，SYBR Premix EX TaqTM10 μL，ROX Reference 0.6 μL。反應(yīng)條件為:95℃ 30 s;95℃ 5 s，60℃ 34 s，共40個循環(huán)。相對定量法計算各個目的基因含量，基因表達定量結(jié)果分析采用比較閾值法:2-ΔΔCt=PCR 擴增完成后用熔解曲線分析法確定產(chǎn)物特異性。

表1 實時熒光定量PCR引物Table 1 Real-time fluorescence quantitative PCR primers

1.7 數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用SPSS 17.0軟件的one-way ANOVA進行方差分析，P＜0.05時為差異顯著，P＜0.01時為差異極顯著。

2 結(jié)果

由表2可見，在正常生理情況下，對照組Caco-2細胞炎癥和抗炎癥細胞因子均無明顯表達;Caco-2細胞分別用腸炎沙門氏菌感染和β-1，3/1，6-葡聚糖處理后，與 Caco-2細胞對照組相比，均極顯著地上調(diào)了促炎癥細胞因子白細胞介素 -1β(IL-1β)和腫瘤壞死因子 -α(TNF-α)基因、趨化因子IL-8基因mRNA表達水平(P＜0.01)，同時也極顯著地上調(diào)了抗炎癥細胞因子白細胞介素-10(IL-10)基因mRNA表達水平(P＜0.01)，然而對抗炎癥細胞因子TGF-β基因mRNA表達水平無顯著影響(P＞0.05)。β-1，3/1，6-葡聚糖和腸炎沙門氏菌與Caco-2細胞共培養(yǎng)之后，與單純腸炎沙門氏菌感染組相比，β-1，3/1，6-葡聚糖顯著地下調(diào)了細胞因子IL-1β、IL-8和 TNF-α基因 mRNA表達水平(P＜0.05)，顯著上調(diào)了 IL-10、TGF-β基因mRNA表達水平(P＜0.05)。為驗證產(chǎn)物特異性，繪制目的基因與內(nèi)參基因熔解曲線如圖1。

表2 β-1，3/1，6-葡聚糖、腸炎沙門氏菌和Caco-2細胞共培養(yǎng)對細胞因子基因mRNA表達水平的影響Table 2 Effects of Caco-2 cells in co-culture with β-1，3/1，6-glucan and Salmonella enteritis on cytokine gene mRNA expression levels

3 討論

本試驗以Caco-2細胞為模型，通過分析β-1，3/1，6-葡聚糖對腸炎沙門氏菌感染Caco-2細胞后主要炎癥和抗炎癥細胞因子基因mRNA表達水平，揭示其抗腸道病原菌感染的免疫機理。

細胞因子是免疫原、絲裂原或其他刺激劑誘導免疫細胞(如單核/巨噬細胞、淋巴細胞等)和非免疫細胞(如成纖維細胞、血管內(nèi)皮細胞、腸道上皮細胞等)產(chǎn)生的一類能在細胞間傳遞信息的低分子質(zhì)量可溶性蛋白質(zhì)或多肽，具有調(diào)節(jié)白細胞生理功能，參與調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，參與免疫應(yīng)答和抗感染、血細胞生成、細胞生長以及損傷組織修復(fù)等多種功能。促炎性細胞因子如白細胞介素-1(IL-1)、白細胞介素 -6(IL-6)、TNF-α、干擾素 - γ(IFN-γ)、IL-12，抗炎性細胞因子如 IL-10、TGF-β、白細胞介素-4(IL-4)和白細胞介素-13(IL-13)，趨化因子如CXC類趨化因子IL-8等，在參與和調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，維持機體正常免疫生理狀態(tài)、抵抗感染中發(fā)揮主要作用。

圖1 各基因熔解曲線Fig.1 The melt curves of the genes

本試驗發(fā)現(xiàn)腸炎沙門氏菌感染Caco-2細胞后，除極顯著上調(diào)炎癥細胞因子IL-1β、TNF-α和IL-8基因mRNA表達水平外，也顯著上調(diào)了抗炎癥細胞因子IL-10基因mRNA表達水平，但對TGF-β基因mRNA表達水平無顯著影響。炎癥細胞因子的變化趨勢與以前報道一致。黃穎等［11］報道腸炎沙門氏菌可誘導Caco-2細胞顯著表達和分泌IL-8。Eckmann等［12］報道沙門氏菌感染腸道上皮細胞(T84、Caco-2細胞)可顯著上調(diào)趨化因子IL-8和促炎癥細胞因子IL-6和TNF-α基因mRNA表達水平和分泌量。同樣，體內(nèi)和體外大量試驗也表明沙門氏菌感染可刺激哺乳動物或家禽免疫系統(tǒng)或免疫細胞類型，如單核/巨噬細胞、中性粒細胞、T細胞、B細胞和樹突狀細胞等表達和分泌許多細胞因子，如促炎癥細胞因子(如 IL-1、TNF-α和IL-6)、趨化因子［如巨噬細胞炎性蛋白 -1α (macrophage inflammatory protein，MIP-1α)、巨噬細胞炎性蛋白 -1β(MIP-1β)、巨噬細胞炎性蛋白 -2α(MIP-2α)和膠質(zhì)細胞趨化因子(keratinocyte chemoattractant，KC)］以及其他一些細胞因子［白細胞介素-12p70(IL-12p70)、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)等］［2，12-14］。本試驗中腸炎沙門氏菌感染 Caco-2細胞后抗炎癥細胞因子TGF-β基因mRNA表達水平的變化趨勢與Bahrami等［2］報道一致，然而抗炎癥細胞因子IL-10基因mRNA表達水平變化趨勢與以往報道［2，12，15］不一致，這些研究者認為沙門氏菌感染可下調(diào)或不改變動物腸道上皮細胞IL-10基因mRNA表達水平，但是 Bahrami等［2］報道空腸彎曲桿菌可誘導腸道上皮細胞系HT-29細胞顯著表達IL-10基因，關(guān)于腸道致病菌誘發(fā)腸道上皮細胞表達抗炎癥細胞因子的具體原因尚需進一步探討?？傮w來看，上述試驗結(jié)果表明，盡管感染的宿主細胞類型不同，但沙門氏菌感染均可誘發(fā)宿主表現(xiàn)炎癥反應(yīng)。這些炎癥細胞因子在吸引白細胞、T細胞等到炎癥部位，激活機體先天性免疫和獲得性免疫系統(tǒng)，抵抗沙門氏菌感染中發(fā)揮了主要作用［12，16］。此外，也有研究表明，一些腸道致病菌，如沙門氏菌、致病性大腸桿菌的外膜蛋白抗原物質(zhì)［如脂多糖(LPS)等］可通過免疫細胞表面模式識別受體(pattern recognization receptor，PRR)，如 Toll樣受體家族(Toll-like receptors，TLRs)、dectin-1和清道夫(scavenger)受體，激活細胞內(nèi)核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)信號通路，通過調(diào)節(jié)細胞表達和分泌免疫調(diào)節(jié)相關(guān)細胞因子從而調(diào)節(jié)免疫炎癥反應(yīng)［16-18］。腸道上皮細胞表面也存在一些模式識別受體，如 TLRs［19］。沙門氏菌的 LPS是否也通過識別Caco-2細胞表面TLRs而誘導其表達免疫調(diào)節(jié)相關(guān)細胞因子，值得進一步探討。

同時，本試驗中單純應(yīng)用水溶性黑酵母β-1，3/1，6-葡聚糖刺激 Caco-2細胞后，促炎癥細胞因子 IL-1β和 TNF-α基因、趨化因子 IL-8基因及抗炎癥細胞因子IL-10和TGF-β基因mRNA表達水平的變化趨勢與腸炎沙門氏菌感染完全一致。具體原因可能與腸炎沙門氏菌感染腸道的外膜糖蛋白LPS與β-1，3/1，6-葡聚糖結(jié)構(gòu)相似，均屬微生物多糖，屬相同的病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular pattern，PAMP)，且識別細胞表面相同的模式識別受體 PRR，如TLRs、dectin-1 和 scavenger 受 體［20］。 然 而，β-1，3/1，6-葡聚糖是一種有效的免疫調(diào)節(jié)劑，可刺激Caco-2細胞表達促炎癥因子和抗炎癥細胞因子，是一種增強腸道黏膜免疫抵抗力的表現(xiàn)，間接增強巨噬細胞活性，而沙門氏菌的LPS誘發(fā)腸道上皮細胞表達炎癥細胞因子趨勢是一種免疫炎癥反應(yīng)，主要間接導致多形核細胞和白細胞聚集［4］。同樣，體內(nèi)和體外大量研究也表明，β-1，3/1，6-葡聚糖可調(diào)節(jié)機體免疫系統(tǒng)或免疫細胞表達不同類型細胞因子［10］，從而增強宿主免疫機能。

本試驗結(jié)果表明，與單純腸炎沙門氏菌感染組相比，黑酵母β-1，3/1，6-葡聚糖和腸炎沙門氏菌共培養(yǎng)后，可顯著降低腸炎沙門氏菌誘發(fā)Caco-2細胞產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)，表現(xiàn)為炎癥細胞因子IL-1β和 TNF-α基因、趨化因子 IL-8基因 mRNA表達水平顯著下調(diào)，而抗炎癥細胞因子IL-10和TGF-β基因mRNA表達水平顯著上調(diào)。同樣，體內(nèi)試驗也表明β-1，3/1，6-葡聚糖可通過下調(diào)炎癥細胞因子，如IL-1β和TNF-α基因及上調(diào)抗炎癥細胞因子IL-10基因、誘發(fā)免疫細胞呼吸爆發(fā)和吞噬細胞能力增強等來抵抗一些腸道致病菌，如沙門氏菌、致病性大腸桿菌感染［10，21］?？傊?，本試驗結(jié)果說明，黑酵母β-1，3/1，6-葡聚糖對腸道致病菌感染誘發(fā)腸道黏膜免疫炎癥反應(yīng)有抑制作用。從Caco-2細胞受體介導的細胞信號傳導途徑探討β-1，3/1，6-葡聚糖激活Caco-2細胞表達和分泌細胞因子而抵抗腸道致病菌感染的分子機制，是未來值得探討的內(nèi)容。

4 結(jié)論

黑酵母β-1，3/1，6-葡聚糖能通過下調(diào)促炎性細胞因子和上調(diào)抗炎性細胞因子的表達抑制腸炎沙門氏菌感染引起的腸道上皮細胞的免疫炎癥反應(yīng)。

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