姜 啟 晨，叢 麗 娜，宋 明 徽，譚 廣 毅，盧 冬

(大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，遼寧 大連 116034)

0 引 言

溶菌酶(Lysozyme，EC3.2.1.17)，是一種堿性蛋白酶，專門作用于細(xì)菌的細(xì)胞壁，使細(xì)菌細(xì)胞壁中的N－乙酰胞壁酸和N－乙酰葡萄糖胺之間的β－1，4糖苷鍵斷裂，導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞發(fā)生裂解，產(chǎn)生溶菌現(xiàn)象，從而起到殺死細(xì)菌的作用。它廣泛存在于動(dòng)植物和微生物的組織、體液及分泌物中，在生物機(jī)體的免疫防御系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用[1]，是天然的抗菌劑、免疫增強(qiáng)劑和防腐劑[2]。研究表明，溶菌酶可以與帶負(fù)電荷的病毒蛋白直接結(jié)合，還可以同DNA、RNA和脫輔基蛋白形成復(fù)鹽，從而使病毒失活[3]。

海參溶菌酶屬于i－型溶菌酶[4]，與蛋清c－型溶菌酶不同，i－型溶菌酶不但可以對(duì)革蘭陽性菌有抑菌作用，對(duì)于能引起水產(chǎn)生物病害的革蘭陰性菌同樣具有抑菌效果[5]。海參溶菌酶具有異構(gòu)肽活性，也稱為它的非酶活性，這與該溶菌酶基因的C端區(qū)域的DNA結(jié)構(gòu)有關(guān)[6]。常藝海等[7]已將海參溶菌酶C端多肽基因在大腸桿菌原核細(xì)胞中得到高效表達(dá)。本研究采用具有易操作、高級(jí)的蛋白質(zhì)翻譯后加工修飾功能和高穩(wěn)定性等特點(diǎn)[8]的真核畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)，將海參溶菌酶C端多肽基因連接到表達(dá)載體pPIC9K上進(jìn)行分泌表達(dá)，以期為進(jìn)一步研究和生產(chǎn)海參溶菌酶C端多肽高活性產(chǎn)品奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

畢赤酵母 GS115、表達(dá)載體pPIC9K，Invitrogen公司；大腸桿菌DH5α和克隆載體pMD18－T，TaKaRa 公 司；pMD18－T－SjLys－C／DH5α，本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保藏。

1.1.2 試劑與工具酶

限制性核酸內(nèi)切酶(EcoRⅠ、NotⅠ、BglⅡ)、Taq DNA聚合酶、T4DNA連接酶、即用型蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、DNA Ladder Marker，TaKaRa公司。質(zhì)粒提取試劑盒和瓊脂糖凝膠電泳DNA回收試劑盒，TIANGEN生化科技(北京)有限公司；Geneticin(G418)，索萊寶科技(北京)有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方 法

1.2.1 特異性引物設(shè)計(jì)

以海參溶菌酶C端多肽基因[6]為模版，利用Primer Premier 5.0軟件，設(shè)計(jì)用于真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的特異性引物 HS－C－1，HS－C－2，并分別添加EcoRⅠ和NotⅠ限制性酶切位點(diǎn)(下劃線表示)：

HS－C－1：GCGTGAATTCGTGATGGGAGGTAGTCTGG；

HS－C－2：TGCGGCCGCCTACTCAGTTGTTGCTC。

1.2.2 SjLys－C基因的擴(kuò)增

以本 實(shí) 驗(yàn) 室 構(gòu) 建 好 的 pMD18－T－SjLys－C／DH5α菌株提取的質(zhì)粒為模板，PCR反應(yīng)循環(huán)參數(shù)為94℃5min；94℃30s，62℃30s，72℃50s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。將PCR產(chǎn)物與pMD18－T Vector在T4DNA連接酶作用下進(jìn)行連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD18－T－SjLys－C并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌(DH5α)感受態(tài)細(xì)胞中，取200μL涂布于含適量Amp、X－Gal、IPTG的LB平板培養(yǎng)基上，37℃過夜培養(yǎng)。挑選出經(jīng)菌落PCR和雙酶切驗(yàn)證正確的陽性菌株，送北京華大基因測(cè)序公司測(cè)序驗(yàn)證。

1.2.3 構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K－SjLys－C

將測(cè)序驗(yàn)證的正確的克隆質(zhì)粒pMD18－TSjLys－C和表達(dá)載體pPIC9K分別用EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切，回收SjLys－C目的基因和帶有黏性末端的pPIC9K載體，在T4DNA連接酶作用下16℃連接過夜，轉(zhuǎn)化至DH5α菌株中。將經(jīng)菌落PCR和雙酶切驗(yàn)證及測(cè)序驗(yàn)證正確后的重組表達(dá)質(zhì)粒命名為pPIC9K－SjLys－C。

1.2.4 pPIC9K－SjLys－C 轉(zhuǎn)化畢赤酵母 GS115及篩選

將GS115感受態(tài)細(xì)胞和經(jīng)BglⅡ線性化的pPIC9K－SjLys－C相混合，將其放入預(yù)冷的2mm的電轉(zhuǎn)杯中，置于冰上10min，在1.5kV、200Ω的條件下電擊，反應(yīng)完成后立即加入1mL預(yù)冷的1mol／L的山梨醇，取350μL涂布于 MD平板，30℃培養(yǎng)至轉(zhuǎn)化子出現(xiàn)，再將轉(zhuǎn)化子經(jīng)96孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)，最后將轉(zhuǎn)化子點(diǎn)種到不同濃度抗生素G418(0.5～4.0mg／mL)的YPD平板培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)，直至長(zhǎng)出單菌落。

1.2.5 SjLys－C基因的誘導(dǎo)表達(dá)

將在含G418 4.0mg／mL的YPD平板上生長(zhǎng)的重組畢赤酵母菌株接種到10mL的BMGY液體培養(yǎng)基中發(fā)酵，30℃、220r／min搖床培養(yǎng)18h，再按1%的接種量將其轉(zhuǎn)接到25mL的BMGY培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，30℃、230r／min擴(kuò)大培養(yǎng)20～24h，當(dāng)菌液OD600達(dá)到4.0～5.0時(shí)，4 000r／min、4 ℃ 離心10min，棄上清，用25mL BMMY培養(yǎng)基重懸菌體，30℃、250r／min振蕩培養(yǎng)，每隔24h取樣1mL同時(shí)加入純甲醇至培養(yǎng)液中甲醇為1.0%進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，培養(yǎng)至96h。將誘導(dǎo)表達(dá)液在15 000r／min離心5min，上清液經(jīng)TCA濃縮，沉淀其蛋白，進(jìn)行SDSPAGE電泳檢測(cè)。

1.2.6 重組海參溶菌酶C端多肽的抑菌活性分析

采用管碟法[9]對(duì)重組海參溶菌酶C端多肽進(jìn)行抑菌活性分析。選取革蘭陽性菌溶壁微球菌(Micrococcuslysodeikticus)和金黃色葡萄球菌(Staphyloccocusaureus)、革蘭陰性菌副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)和銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)作為指示菌，分別取上述指示菌培養(yǎng)液200μL(濃度2.9×109CFU／mL，稀釋倍數(shù)10－4)均勻涂布于LB固體平板培養(yǎng)基上，放入無菌牛津杯，向其加入200μL重組畢赤酵母基因工程菌的發(fā)酵液，30℃培養(yǎng)18h，測(cè)定抑菌圈直徑。重復(fù)3次，取實(shí)驗(yàn)結(jié)果平均值。

2 結(jié)果與討論

2.1 SjLys－C基因的擴(kuò)增與重組克隆質(zhì)粒的鑒定

以海參溶菌酶C端多肽基因?yàn)槟０?，設(shè)計(jì)特異性引物 HS－C－1和 HS－C－2，分別帶有EcoRⅠ和NotⅠ限制性酶切位點(diǎn)，經(jīng)PCR反應(yīng)得到長(zhǎng)度約為260bp擴(kuò)增產(chǎn)物(圖1)，與預(yù)期大小一致。將構(gòu) 建 好 的 pMD18－T－SjLys－C 用EcoRⅠ 和NotⅠ進(jìn)行雙酶切鑒定，結(jié)果顯示目的帶大小與預(yù)計(jì)一致。再將提取的重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，結(jié)果表明它與SjLys－C基因序列[10]完全一致，這表明重組克隆質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖1 PCR擴(kuò)增目的基因Fig.1 Amplification of the target DNA by PCR

2.2 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及驗(yàn)證

將測(cè)序驗(yàn)證正確的pMD18－T－SjLys－C 和pPIC9K分別用EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切，二者過夜連接并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α中，提取質(zhì)粒并進(jìn)行雙酶切和菌落PCR驗(yàn)證。結(jié)果表明在260bp出現(xiàn)目的條帶(圖2)，將該重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，它與SjLys－C基因序列[10]完全一致，這表明重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K－SjLys－C構(gòu)建成功。

2.3 重組海參溶菌酶C端多肽的誘導(dǎo)表達(dá)

圖2 重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K－SjLys－C的雙酶切鑒定Fig.2 Identification of the recombinant plasmid pPIC9K－SjLys－C digested by EcoRⅠand NotⅠ

將線性化的重組質(zhì)粒pPIC9K－SjLys－C電轉(zhuǎn)化至畢赤酵母中，篩選高拷貝的工程菌株，其培養(yǎng)液加1%甲醇誘導(dǎo)表達(dá)96h，分別收集不同時(shí)間發(fā)酵液的上清液，采用12%的SDS－PAGE電泳進(jìn)行目的蛋白表達(dá)分析。海參溶菌酶C端多肽基因經(jīng)生物學(xué)軟件分析，它編碼77個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)分子質(zhì)量為8.72ku。由圖3可見，泳道2～5在分子質(zhì)量為8.8ku附近出現(xiàn)明顯的目的條帶，而作為陰性對(duì)照的第一泳道在8.8ku處無條帶出現(xiàn)，證明海參溶菌酶C端多肽在畢赤酵母GS115中得到成功表達(dá)且72h目的蛋白表達(dá)量最高。

圖3 重組海參溶菌酶C端多肽的SDSPAGE分析Fig.3 Expression of the recombinant SjLys－C by SDS－PAGE analysis

2.4 重組海參溶菌酶C端多肽的抑菌實(shí)驗(yàn)

采用管碟法測(cè)定重組海參溶菌酶C端多肽的抑菌活性。結(jié)果顯示，該重組海參溶菌酶C端多肽對(duì)實(shí)驗(yàn)選用的4種指示菌均有不同程度的抑菌效果，其中對(duì)革蘭陽性菌M.lysodeikticus和S.aureus的抑菌直徑分別為10和9mm，對(duì)革蘭陰性菌V.parahaemolyticus和P.aeruginosa的抑菌直徑分別為17和16mm(標(biāo)準(zhǔn)差為0.45～0.61mm)。這表明重組海參溶菌酶C端多肽對(duì)革蘭陽性菌和革蘭陰性菌具有廣譜抗菌作用(圖4)，尤其對(duì)引起海洋生物病害的主要致病菌副溶血弧菌和銅綠假單胞菌有更強(qiáng)的抑菌作用。

圖4 重組海參溶菌酶C端多肽的抑菌活性Fig.4 The antibacterial activity of the recombinant SjLys－C

3 結(jié) 論

通過PCR的方法成功擴(kuò)增出海參溶菌酶C端多肽基因，構(gòu)建成表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K－SjLys－C，將其線性化后經(jīng)電轉(zhuǎn)化導(dǎo)入GS115中，構(gòu)建并篩選出高拷貝的基因工程菌pPIC9K－SjLys－C／GS115。該工程菌的甲醇誘導(dǎo)發(fā)酵液經(jīng)SDSPAGE電泳檢測(cè)，結(jié)果成功得到重組海參溶菌酶C端多肽目的蛋白。對(duì)重組海參溶菌酶C端多肽進(jìn)行抑菌活性分析，重組海參溶菌酶C端多肽對(duì)革蘭陽性菌溶壁微球菌、金黃色葡萄球菌、革蘭陰性菌副溶血弧菌和銅綠假單胞菌均有不同程度的抑菌效果，其中副溶血弧菌和銅綠假單胞菌是水產(chǎn)生物的主要致病菌，對(duì)于海水魚類、甲殼類等多種水產(chǎn)動(dòng)物具有嚴(yán)重危害，而海參溶菌酶C端多肽對(duì)這兩種致病菌均顯示出了較強(qiáng)的抑菌效果。

畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)是當(dāng)前世界應(yīng)用最為廣泛的酵母表達(dá)系統(tǒng)，它不僅具有高表達(dá)、高分泌和高穩(wěn)定的特點(diǎn)，而且可以進(jìn)行翻譯后的加工處理將目的蛋白分泌到細(xì)胞外，美國(guó)FDA已經(jīng)評(píng)定畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生的基因工程產(chǎn)品是安全的。因此將具有抗菌活性的海參溶菌酶C端片段置于畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中，利用工程菌高密度發(fā)酵生產(chǎn)大量的抗菌多肽產(chǎn)品，這對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)病害的預(yù)防具有非常重大的意義。本研究為進(jìn)一步研究海參溶菌酶結(jié)構(gòu)與功能及其C端多肽在真核系統(tǒng)中的表達(dá)奠定了基礎(chǔ)，也為大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)提供了依據(jù)。

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