宋 明 徽, 叢 麗 娜, 王 紅 英, 姜 啟 晨

( 大連工業(yè)大學 生物工程學院, 遼寧 大連 116034 )

0 引 言

蛋白酶是在一定的溫度和pH條件下催化蛋白質(zhì)水解成小肽和氨基酸的一類生物酶。蛋白酶是很重要的水解酶類,在飼料、醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域中具有重要的作用,廣泛存在于動物內(nèi)臟、植物莖葉果實以及微生物中[1]。堿性蛋白酶是在堿性條件下水解蛋白質(zhì)肽鍵的酶類,一般pH為9.0～11.0。中性偏堿性的蛋白酶作為飼料酶在水產(chǎn)養(yǎng)殖的應(yīng)用越來越受到關(guān)注。由于水產(chǎn)動物消化系統(tǒng)不如畜禽完善,內(nèi)源酶分泌沒有畜禽完全,這樣容易影響對飼料中營養(yǎng)成分消化吸收,需外源酶添加輔助消化[2]。若在飼料中添加蛋白酶,可使高分子的蛋白質(zhì)降解為低分子的肽及各種氨基酸,易被消化吸收,提高飼料利用效率。水產(chǎn)動物大多數(shù)只有消化道,其消化道環(huán)境呈中性或偏堿性[3],因此水產(chǎn)飼料中添加外源酶時需注意選擇適宜中性偏堿性等條件下的酶類,才能達到較佳效果。

從海洋微生物中尋找特異活性的堿性蛋白酶作為飼料添加酶更具有相容性,而且海洋環(huán)境的多樣性與獨特性造就了海洋微生物自身具有獨到的優(yōu)越性[4],并且具有優(yōu)勢的海洋細菌篩選也為水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中所需求的益生菌提供了資源。本研究從海洋微生物中篩選一株具有高產(chǎn)堿性蛋白酶優(yōu)勢的菌株,并對其所產(chǎn)蛋白酶的酶學性質(zhì)和發(fā)酵條件進行研究,進一步提高了該菌株的產(chǎn)蛋白酶能力,為水產(chǎn)飼料添加酶的生產(chǎn)應(yīng)用以及水產(chǎn)飼用益生菌的研究提供了充實的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 試驗材料

以大連海域采集的貝類、海魚、海參等為試驗材料。

1.1.2 培養(yǎng)基

2216E培養(yǎng)基[5]:蛋白胨5 g,酵母膏1 g,磷酸鐵0.1 g,瓊脂20 g,海水1 000 mL,pH 8.0。

富集培養(yǎng)基:蛋白胨1 g,酵母膏5 g,牛肉膏5 g,海水1 000 mL,pH 8.0。

分離培養(yǎng)基:干酪素10 g,瓊脂20 g,海水1 000 mL,pH 8.0。

產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基:蛋白胨10 g,牛肉膏3 g,NaCl 5 g,去離子水1 000 mL,pH 8.0。

1.1.3 主要試劑和儀器

牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、瓊脂粉、干酪素均購自北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司；其他常用試劑均來自國產(chǎn)試劑公司；紫外/可見光分光光度計,上海精密科學儀器有限公司；恒溫水浴鍋,上海嘉鵬科技有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 菌種篩選

初篩:將海參腸、貝類以及魚的內(nèi)臟剪碎后放入無菌海水浸泡過夜,取上清液1 mL放入富集培養(yǎng)基,28 ℃、160 r/min搖床培養(yǎng)48 h；將富集培養(yǎng)液進行稀釋,分別涂布于分離培養(yǎng)基,培養(yǎng)3～4 d[6]；挑取透明圈顏色、形態(tài)各不相同的較大單個菌落劃線分離純化,直到得到純的菌株,并于2216E斜面保藏[7]。將已純化的菌株接種于種子培養(yǎng)基,28 ℃、160 r/min搖床培養(yǎng)24 h,將無菌濾紙片貼于酪蛋白平板上,吸取5 μL發(fā)酵液滴于濾紙片上,28 ℃恒溫培養(yǎng)48 h,挑取水解圈與菌苔直徑比值較大的菌株保存[8]。

復(fù)篩:將初篩中得到的菌株接入發(fā)酵培養(yǎng)基,30 ℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)48 h。發(fā)酵液在4 ℃、10 000 r/min下離心10 min,分離得到上清液為粗酶液,進行蛋白酶酶活測定。采用Folin酚顯色法測定粗酶液活性。

1.2.2 菌株HS-A156產(chǎn)蛋白酶性質(zhì)的初步研究

1.2.2.1 溫度對蛋白酶活力和熱穩(wěn)定性影響

將菌株HS-A156的粗酶液分別置于25、30、35、40、45、50、55、60 ℃下測定蛋白酶活力,以確定酶的最適作用溫度[9]。該粗酶液在不同溫度下保溫2 h,在40 ℃下測定剩余蛋白酶活力,以未處理的酶液的酶活力為100%。

1.2.2.2 pH對蛋白酶活力和穩(wěn)定性的影響

采用pH為6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0、13.0的緩沖溶液配制酪蛋白底物溶液,測定在不同pH下的蛋白酶活力[10],以確定酶的最適作用pH。用不同pH的緩沖液稀釋酶液,保溫1 h,40 ℃下測定剩余蛋白酶活力,以未處理的酶液的酶活力為100%。

1.2.3 發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基的優(yōu)化

以2216E培養(yǎng)基作為種子液培養(yǎng)基,種子液培養(yǎng)12 h達到最佳種齡(OD600=1.3),2%接種量,培養(yǎng)溫度30 ℃,搖床轉(zhuǎn)速160 r/min,發(fā)酵48 h。在無碳培養(yǎng)基中,分別加入1%葡萄糖、蔗糖、乳糖、玉米粉、可溶性淀粉,測定菌株HS-A156的產(chǎn)酶能力,以確定最佳碳源。在已確定碳源的培養(yǎng)基中,分別加入1%牛肉膏、酵母粉、豆粕粉、尿素、硫酸銨、牛肉膏和酵母粉混合料、豆粕粉和酵母粉混合料,其他條件相同,以確定最佳氮源。在已經(jīng)選定的碳源和氮源的培養(yǎng)基中,分別加入0.05% Mg2+、Ca2+、K+、Fe2+、Zn2+,其他條件相同,測定其酶活力,考察金屬離子對菌株HS-A156產(chǎn)酶的影響。最后利用L9(34)正交試驗(表1)來確定該菌株發(fā)酵產(chǎn)酶的最佳培養(yǎng)基組成。

表1 正交試驗因素水平表Tab.1 The factors and levels of orthogonal experiment

1.2.4 發(fā)酵產(chǎn)酶條件的優(yōu)化

在已優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上,通過分別改變培養(yǎng)基的初始pH、培養(yǎng)溫度和接種量,確定最佳的培養(yǎng)基初始pH、培養(yǎng)溫度和接種量,從而確定最終的發(fā)酵產(chǎn)酶條件。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株的篩選

從大連海域采集的貝類、海魚、海參中分離純化出73株產(chǎn)蛋白酶的海洋細菌,利用酪蛋白培養(yǎng)基對菌株進一步篩選,得到23株具有較強水解酪蛋白能力的菌株。再采用Folin酚法通過測定發(fā)酵液酶活力進行復(fù)篩,最后從海參腸道中篩選出一株產(chǎn)堿性蛋白酶活力最高而且遺傳性能穩(wěn)定的海洋細菌,命名為HS-A156。

2.2 菌種鑒定

菌株HS-A156的菌落形態(tài)近似圓形,乳白色,濕潤,邊緣光滑,易挑取。在顯微鏡下可以觀察到該菌株呈長桿狀,細胞染色為藍紫色,為革蘭氏陽性菌。將菌株HS-A156進行測序,其16S rDNA序列經(jīng)過分析比對后,初步判斷該菌株為枯草芽孢桿菌(B.subtilis)。已將該序列提交到GenBank中,檢索號為KC166863。

2.3 溫度對蛋白酶活力和熱穩(wěn)定性的影響

由圖1可知,菌株HS-A156所產(chǎn)蛋白酶最適反應(yīng)溫度為40 ℃。粗酶液在上述溫度下分別保溫2 h,測定酶活力。結(jié)果表明,起初隨著溫度上升酶活性逐漸升高,但40 ℃后,酶活力迅速下降。在25～40 ℃酶活力維持在較高水平,45 ℃ 時酶活力雖然開始下降,但其相對酶活力仍達到58.2%,所以初步推斷在25～45 ℃,該菌株產(chǎn)生的蛋白酶具有良好的熱穩(wěn)定性,尤其在25 ℃低溫環(huán)境下菌株HS-A156所產(chǎn)堿性蛋白酶的酶活力保持在99%以上,這與一些嗜高溫堿性蛋白酶相比,菌株HS-A156所產(chǎn)堿性蛋白酶,作為水產(chǎn)飼料添加酶能夠適應(yīng)海洋水產(chǎn)動物低溫養(yǎng)殖生長的特點,減少飼料添加酶的損失。

圖1 溫度對酶活力及穩(wěn)定性的影響Fig.1 Effect of temperature on enzyme activity and stability

2.4 pH對蛋白酶活力和穩(wěn)定性的影響

由圖2可知,pH為9.0時該酶活力最高,當pH大于其最適pH時,酶活力迅速下降。該粗酶液在pH 8.0的緩沖液中保溫1 h后,酶活保持89.0%,在pH 11.0的緩沖溶液中保溫1 h后,酶活只喪失了21.9%,這說明該酶在 pH 8.0～11.0范圍內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性。該酶作為海洋水產(chǎn)飼料添加酶能夠適應(yīng)水產(chǎn)動物腸道內(nèi)偏堿性的環(huán)境,提高酶的利用效率,增強飼料添加酶的相容性。

圖2 pH對酶活力及穩(wěn)定性的影響Fig.2 Effect of pH on enzyme activity and stability

2.5 菌株HS-A156發(fā)酵培養(yǎng)基條件優(yōu)化

2.5.1 發(fā)酵培養(yǎng)基碳源優(yōu)化

考察不同碳源對菌株HS-A156產(chǎn)酶的影響。由圖3可知,不同碳源對菌株HS-A156產(chǎn)蛋白酶活性影響較大,其中以葡萄糖作為碳源酶活力最高,而可溶性淀粉相對較低。這可能是由于葡萄糖是容易被利用的單糖,結(jié)構(gòu)簡單,不需要降解和轉(zhuǎn)化。因此,選擇葡萄糖作為培養(yǎng)基的碳源。

圖3 碳源對產(chǎn)酶的影響Fig.3 Effects of carbon sources on protease production

2.5.2 發(fā)酵培養(yǎng)基氮源優(yōu)化

考察不同氮源對菌株HS-A156產(chǎn)酶影響。由圖4可知,以牛肉膏和酵母粉組成的復(fù)合氮源作為產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源時,菌株HS-A156產(chǎn)蛋白酶活力最高,為242 U/mL；而采用銨鹽、尿素作為發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源時,酶活最低,這說明與有機氮源相比,無機氮源不利于菌株HS-A156的產(chǎn)酶發(fā)酵,而有機氮源當中的復(fù)合氮源優(yōu)于單一氮源。因此,采用牛肉膏和酵母粉組成的復(fù)合氮源作為菌株HS-A156的產(chǎn)酶發(fā)酵的最佳氮源。

圖4 氮源對產(chǎn)酶的影響Fig.4 Effects of nitrogen sources on protease production

2.5.3 不同金屬離子對產(chǎn)酶的影響

通過添加5種金屬離子,測定各種金屬離子對菌株HS-A156產(chǎn)酶的影響。由圖5可知,適量的Ca2+能顯著提高HS-A156菌株產(chǎn)蛋白酶量,其蛋白酶活力達到257 U/mL,而Fe2+、Zn2+對產(chǎn)酶有較強的抑制作用。因此可以在培養(yǎng)基中加入適量的Ca2+,以提高該菌株的產(chǎn)蛋白酶能力。

圖5 金屬離子對產(chǎn)酶的影響Fig.5 Effect of various metal ions on protease production

2.5.4 培養(yǎng)基優(yōu)化正交試驗

為了進一步考察培養(yǎng)基組分中葡萄糖、牛肉膏、酵母粉、Ca2+4種因素的含量對產(chǎn)酶的影響,利用L9(34)正交試驗來確定最佳培養(yǎng)基,以提高菌株HS-A156的產(chǎn)蛋白酶量。

表2 正交試驗數(shù)據(jù)分析表Tab.2 Data analysis of orthogonal test

從表2極差分析看出,在考察的4個因素中,對產(chǎn)酶影響的大小關(guān)系為B>D>A>C,培養(yǎng)基中牛肉膏濃度因素的極差值R最大,說明該因素對產(chǎn)酶影響最大,其次是Ca2+的質(zhì)量分數(shù),然后是葡萄糖質(zhì)量分數(shù),酵母粉質(zhì)量分數(shù)的極差值R最小,其對產(chǎn)酶的影響最小。通過培養(yǎng)基優(yōu)化正交試驗,選出最佳實驗方案為A2B1C3D2,即葡萄糖1.5%、牛肉膏1.0%、酵母粉2.0%和CaCl20.05%,在此培養(yǎng)基條件下測得蛋白酶活力為519 U/mL。

2.6 菌株HS-A156發(fā)酵產(chǎn)酶條件優(yōu)化

2.6.1 培養(yǎng)基初始pH對產(chǎn)酶的影響

由圖6可知,在pH 7.5～8.5時,產(chǎn)酶活力比較穩(wěn)定,說明偏堿性的條件下較利于菌株的生長和營養(yǎng)物質(zhì)的吸收,進而有利于蛋白酶的生成,其中當pH=8.0時,酶活力最高為524 U/mL。

圖6 培養(yǎng)基初始pH對產(chǎn)酶的影響Fig.6 Effects of initial pH in fermentative medium on protease production

2.6.2 發(fā)酵溫度對產(chǎn)酶的影響

由圖7可知,發(fā)酵溫度在25～30 ℃時酶活力比較穩(wěn)定,這由于溫度25～30 ℃適于菌株HS-A156生長,過高的溫度將會不利于菌體生長,因而其在30 ℃時產(chǎn)酶量最高達516 U/mL。

圖7 發(fā)酵溫度對產(chǎn)酶的影響Fig.7 Effects of culture temperature on protease production

2.6.3 接種量對產(chǎn)酶的影響

由圖8可知,接種量在2%～4%時其酶活力比較穩(wěn)定。當接種量為1%時,由于菌體細胞數(shù)量太少而不利于產(chǎn)酶,但接種量過高時,菌體數(shù)量過多,生長期時營養(yǎng)物質(zhì)消耗太多,產(chǎn)酶期時營養(yǎng)物質(zhì)濃度下降,也不利于產(chǎn)酶。因此,接種量在3%時最優(yōu)。

圖8 接種量對產(chǎn)酶的影響Fig.8 Effects of inoculation quantity on protease production

綜合以上各個實驗研究,在選擇最佳培養(yǎng)基成分的基礎(chǔ)上,培養(yǎng)基初始pH為8.0、發(fā)酵過程培養(yǎng)溫度為30 ℃、接種量為3%,菌株HS-A156發(fā)酵48 h,其發(fā)酵液中產(chǎn)生的蛋白酶酶活力達到最高,為538 U/mL。此優(yōu)化條件為該菌株的最佳產(chǎn)酶發(fā)酵條件。

3 結(jié) 論

從海參腸道中篩選出一株產(chǎn)堿性蛋白酶較強的海洋枯草芽孢桿菌HS-A156。該菌株所產(chǎn)堿性蛋白酶最適溫度為40 ℃,在25～45 ℃具有良好的熱穩(wěn)定性,屬于一種中低溫蛋白酶,與其他嗜熱堿性蛋白酶相比,適于海洋水產(chǎn)動物低溫養(yǎng)殖的特點。該酶最適pH為9.0,在pH 8.0～11.0具有良好的pH穩(wěn)定性。

最適產(chǎn)酶培養(yǎng)基組成為葡萄糖1.5%、牛肉膏1.0%、酵母粉2.0%、CaCl20.05%；最佳發(fā)酵條件為培養(yǎng)基初始pH 8.0、發(fā)酵溫度30 ℃、接種量3%。經(jīng)過發(fā)酵產(chǎn)酶優(yōu)化之后,菌株HS-A156所產(chǎn)堿性蛋白酶的活力達到了538 U/mL,比優(yōu)化前提高了3.7倍。這個結(jié)果優(yōu)于夏振強等[11]研究的海洋細菌L1-9菌株的產(chǎn)酶量128.3 U/mL,孫謐等[12]研究的海洋細菌YS-9412-130的產(chǎn)酶量180 U/mL。

綜上所述,本研究成功地篩選出高產(chǎn)堿性蛋白酶的海洋細菌HS-A156以及對其所產(chǎn)蛋白酶性質(zhì)、發(fā)酵條件等進行了初步探索,為下一步海洋益生菌及海洋生物酶水產(chǎn)飼用方面的研究與應(yīng)用提供了充實的理論基礎(chǔ)。

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