劉 軍, 陳 顯 化, 金 朝 霞, 王 冰, 張 宗 申

( 1.大連工業(yè)大學(xué) 遼寧省發(fā)酵工程重點實驗室, 遼寧 大連 116034;2.周口師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院, 河南 周口 466000 )

0 引 言

金鐵鎖PsammosilenetunicoidesW.C. WuetC.Y.Wu是我國中成藥保密品種“云南白藥”的重要成分之一,屬于珍貴瀕危中藥材。1999年作為國家二級保護植物被列入《國家重點保護野生植物名錄(第一批)》[1]。

發(fā)根農(nóng)桿菌是根瘤菌科農(nóng)桿菌屬的一種革蘭氏陰性好氧土壤細菌,能感染大多數(shù)雙子葉植物和少數(shù)單子葉植物及個別裸子植物形成毛狀根。毛狀根具有生長速度快、遺傳穩(wěn)定性高、次級代謝能力強等生長優(yōu)勢[2-3]。隨著大量珍貴中藥材處于瀕危滅絕和品種退化,利用發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒轉(zhuǎn)化形成毛狀根并建立毛狀根液體懸浮培養(yǎng)體系成為當代植物生物技術(shù)的研究熱點[4-5]。研究表明,在植物根系生長過程中,氮源的供應(yīng)形式和濃度對根系建成、發(fā)育有很大影響,磷源和氮源之間也有協(xié)同作用。本實驗研究了氮源和磷源對金鐵鎖毛狀根在液體條件下的生長發(fā)育以及次生代謝成分積累的影響,研究結(jié)果對工業(yè)化生產(chǎn)金鐵鎖毛狀根從而解決其藥用資源緊缺問題具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 材 料

發(fā)根農(nóng)桿菌為本實驗室保存的ACCC10060,購于中科院菌種保藏中心；金鐵鎖無菌苗為大連工業(yè)大學(xué)珍稀瀕危藥用植物細胞工程實驗室培養(yǎng)。

1.2 方 法

1.2.1 菌種的活化及毛狀根的誘導(dǎo)和培養(yǎng)

實驗方法見參考文獻[6]。

1.2.2 金鐵鎖的毛狀根液體培養(yǎng)基的選擇

選用B5、N6、MS、1/2MS、1/4MS不同的空白培養(yǎng)基對毛狀根液體培養(yǎng),半個月后觀察結(jié)果。

1.2.3 金鐵鎖毛狀根生長曲線的繪制

取優(yōu)質(zhì)毛狀根根尖轉(zhuǎn)入空白的1/2MS液體培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng),向30 mL培養(yǎng)液(100 mL的錐形瓶)中轉(zhuǎn)入0.5 g毛狀根,平行5個樣,每周測1次毛狀根鮮重,取平均值,繪制毛狀根生長曲線。

1.2.4 氮源對毛狀根生長與次級代謝的影響

1.2.5 硝態(tài)氮和磷源在液體培養(yǎng)基的培養(yǎng)周期

取0.5 g優(yōu)質(zhì)毛狀根根尖接種于100 mL錐形瓶中,內(nèi)裝30 mL“1.24”中選出的液體培養(yǎng)基,pH為6.0、75 r/min、(25±1) ℃下暗培養(yǎng),每隔5 d測培養(yǎng)基中的硝態(tài)氮和無機磷濃度,至濃度不再變化,做3個平行樣,結(jié)果取平均值,分別繪制硝態(tài)氮濃度、無機磷濃度與培養(yǎng)時間關(guān)系曲線。

表1 硝態(tài)氮和銨態(tài)氮濃度比Tab.1 The ratio of nitrate nitrogen and ammonium nitrogen

1.2.6 磷源濃度對毛狀根生長與次級代謝影響

以1/2MS液體培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基,KH2PO4濃度分別為0、2.5、5、6.25、 8.75、 12.5、25、50 mmol/L。28 d后觀察其對毛狀根生長和皂苷積累的影響,每種比例做3個平行樣,每瓶接種毛狀根0.5 g,選擇100 mL錐形瓶,裝液量30 mL,計算結(jié)果取平均值。

1.2.7 金鐵鎖毛狀根的測量指標

增長率=(最終收獲干重-接種干重)/接種干重

皂苷產(chǎn)量=收獲干重×皂苷質(zhì)量分數(shù)

2 結(jié)果與討論

2.1 金鐵鎖毛狀根的誘導(dǎo)

被感染的金鐵鎖葉片在2～3 d內(nèi)出現(xiàn)菌斑,將出現(xiàn)菌斑的葉片放入加入頭孢噻肟鈉的MS培養(yǎng)集中除菌,菌除凈后轉(zhuǎn)入光照條件下培養(yǎng),10 d后金鐵鎖葉片上長出白色的細絲狀根,如圖1所示,將白色根進行卡那霉素抗性實驗,具有卡那霉素抗性的為金鐵鎖毛狀根。

圖1 從金鐵鎖葉片誘導(dǎo)的毛狀根Fig.1 Hairy roots induced from Psammosilene tunicoides leaf

2.2 毛狀根培養(yǎng)基的選擇

觀察B5培養(yǎng)基中毛狀根,雖然生長速度快卻容易褐化,MS培養(yǎng)基也會在一定程度上導(dǎo)致毛狀根褐化,N6和1/4MS培養(yǎng)基生長速度都很慢,1/2MS培養(yǎng)基上生長的毛狀根各方面性質(zhì)都很好,所以選擇1/2MS為預(yù)培養(yǎng)的培養(yǎng)基。

2.3 金鐵鎖毛狀根生長周期

將新鮮的毛狀根根尖部位轉(zhuǎn)入空白的1/2MS 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng),其生物量積累與培養(yǎng)時間的關(guān)系如圖2所示。

圖2 金鐵鎖毛狀根液體培養(yǎng)生長曲線Fig.2 Growth curve of Psammosilene tunicoides hairy roots in liquid culture medium

2.4 氮源濃度對金鐵鎖毛狀根生長及次級代謝的影響

圖3 氮源濃度對金鐵鎖毛狀根生長的影響Fig.3 Effects of nitrogen concentration on the growth of Psammosilene tunicoides hairy roots

表2 氮源濃度對毛狀根的生長速度和次級代謝的影響Tab.2 Effects of nitrogen concentration on the growth and secondary metabolism of hairy roots

2.5 毛狀根對培養(yǎng)基中的吸收與利用

圖4 培養(yǎng)液中質(zhì)量濃度的變化Fig.4 Change of content in the medium

2.6 磷源濃度對毛狀根生長和次級代謝的影響

由圖5可知,毛狀根生長與培養(yǎng)基中磷濃度關(guān)系密切。低磷濃度時毛狀根生長緩慢,如1號毛狀根明顯是由于磷源不足而發(fā)生卷曲現(xiàn)象,從2號開始毛狀根生長舒展,隨著無機磷濃度的升高生長速度加快,從6號開始毛狀根出現(xiàn)褐化現(xiàn)象,雖然早期生長速度很快,但隨著褐化逐漸嚴重,毛狀根生長受到抑制；隨著磷濃度的升高,褐化越來越重,褐化時間也越來越早。為了避免褐化對毛狀根生長的不利影響,無機磷的濃度不能超過6號樣中的無機磷濃度即無機磷濃度要低于12.5 mmol/L。

圖5 不同濃度磷源對毛狀根生長的影響Fig.5 Effects of different concentration of phosphorus sources on the growth of hairy roots

表3 磷源濃度對毛狀根生長和次級代謝的影響Tab.3 Effects of phosphate sources on the growth and secondary metabolism of hairy roots

2.7 磷源的消耗速度和培養(yǎng)周期

圖6 培養(yǎng)液中無機磷質(zhì)量濃度的變化Fig.6 Change of phosphorus content in the medium

3 結(jié) 論

[1] 屈燕,虞泓,周湘玲. 珍稀瀕危藥用植物金鐵鎖研究進展[J]. 中華中醫(yī)藥雜志, 2011, 26(8):1795-1796.

[2] 劉曉艷,王清玲,李學(xué)俊. 農(nóng)桿菌Ri誘導(dǎo)丹參毛狀根培養(yǎng)體系的優(yōu)化[J]. 西北農(nóng)業(yè)學(xué)報, 2009, 18(6):183-186.

[3] 楊慧潔,楊世海. 發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的藥用植物遺傳轉(zhuǎn)化研究[J]. 生物技術(shù)通報, 2009(1):16-21.

[4] 黃建安,劉仲華. 毛狀根培養(yǎng)與植物此生代謝物的生產(chǎn)[J]. 微生物學(xué)雜志, 2003, 23(5):35-39.

[5] 張韌,秦玉明,陳文慶,等. 懸浮培養(yǎng)技術(shù)在生物制藥中的應(yīng)用和展望[J]. 中國獸藥雜志, 2011, 45(3):56-60.

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