金 楊，王 燕

（1．大理州中醫(yī)醫(yī)院，云南大理 671000；2．大理學(xué)院藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，云南大理 671000）

巖陀為虎耳草科植物西南鬼燈擎Rodgersia sambucifolia Hemsl.或羽葉鬼燈擎Rodgersia pinnata Hemsl.的干燥根莖，主產(chǎn)于云南、貴州、山西、四川等地〔1〕。具有消炎、收斂、祛風(fēng)除濕的功效，對(duì)腸炎、菌痢、感冒頭痛、風(fēng)濕骨痛、外傷出血、老年性支氣管炎等常見疾病有較好的療效，故在民間廣泛應(yīng)用。對(duì)其有效成分之一的巖白菜素研究已有大量文獻(xiàn)報(bào)道〔2-6〕，但對(duì)巖陀中槲皮素方面的相關(guān)研究報(bào)道卻很罕見。槲皮素具有降低血脂、降低血管脆性、抗炎、抗菌、抗過敏、抗自由基、抗氧化、抗腫瘤、抗癌、延緩衰老、抗病毒；瀉下、增強(qiáng)免疫、解痙等作用〔7-9〕。因此，本文收集不同產(chǎn)地不同采收期的巖陀藥材，對(duì)其中具有廣泛生理活性的槲皮素采用HPLC法進(jìn)行含量測(cè)定〔10〕，為巖陀資源的合理應(yīng)用、保護(hù)，更好地控制巖陀藥材的質(zhì)量以及進(jìn)一步對(duì)該藥材進(jìn)行開發(fā)研究提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 LC-20AD型HPLC系統(tǒng)（日本島津公司，包括CTO-20AC柱溫箱、CBM-20A系統(tǒng)控制器、SPD-M20A二極管陣列檢測(cè)器、LC solution工作站）；Sartorius BS 110S電子天平（上海亞榮生化儀器廠）。

1.2 試藥 槲皮素對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：100081-200406）；甲醇為色譜純（美國(guó)Tidea公司）；水為雙蒸水；其他試劑均為分析純；實(shí)驗(yàn)所用巖陀藥材均由大理學(xué)院藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院生藥教研室周濃副教授鑒定為真品。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件色譜柱：DiamonsilC18（4.6 mm×200mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-0.5%磷酸溶液（50∶50）；檢測(cè)波長(zhǎng)：370 nm；柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL。理論塔板數(shù)按槲皮素峰計(jì)不低于4000。對(duì)照品及樣品色譜。見圖1。

2.4 供試品溶液制備方法的考察

2.4.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 用SPD（二級(jí)管陣列檢測(cè)器）對(duì)槲皮素對(duì)照品溶液和供試品溶液進(jìn)行190～800 nm范圍的光譜掃描，見圖2-3。從圖中可知，槲皮素對(duì)照品溶液和供試品溶液在370 nm都有一個(gè)比較明顯且無干擾的單峰，從槲皮素峰純度值大于0.999可知，本實(shí)驗(yàn)所采用的檢測(cè)條件合理可行，在370 nm處無其他雜質(zhì)峰的干擾。因此，將370 nm作為槲皮素含量測(cè)定的波長(zhǎng)。

圖1 對(duì)照品及樣品色譜圖

圖2 槲皮素對(duì)照品溶液的光譜和峰純度掃描結(jié)果

2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱定干燥至恒重的槲皮素對(duì)照品11.56 mg，置50 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，再精密吸取該溶液5 mL至50 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，再精密吸取該溶液2 mL至10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得濃度為0.004624 mg/mL的對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備 取各編號(hào)的巖陀粉末（過4號(hào)篩）約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇-25%HCl（4∶1）混合溶液50 mL，密塞，稱定重量，置水浴中回流1 h，冷卻，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.4.2 供試品溶液提取時(shí)間的考察 取巖陀2號(hào)樣品1 g各5份，精密稱定，分別回流不同的時(shí)間制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)回流1 h后，槲皮素含量無明顯增加，因此供試品溶液提取時(shí)間選為回流1 h。見表1。

表1 不同提取時(shí)間考察結(jié)果

2.5 線性關(guān)系考察 分別精密吸取槲皮素對(duì)照品溶液（C=0.004624 mg/mL）1、2、3、4、5、6 μL進(jìn)樣，以槲皮素進(jìn)樣量（X）為橫坐標(biāo)，色譜峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得：Y=7497441.97X－6927.93（r=0.9999），結(jié)果表明槲皮素在0.004624～0.02774 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.6 精密度試驗(yàn) 分別精密吸取槲皮素對(duì)照品溶液（C=0.004624 mg/mL）10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次測(cè)定，色譜峰面積的RSD為0.12%。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取巖陀2號(hào)樣品1 g，精密稱定，分別于2、3、4、5、6、24 h進(jìn)樣測(cè)定，色譜峰面積的RSD為0.59%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性較好。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱定巖陀2號(hào)樣品6份，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別進(jìn)樣10 μL進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算槲皮素含量，其RSD為1.43%，表明方法重復(fù)性良好。見表2。

表2 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

2.9 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱定已知槲皮素含量（0.1788 mg/g）的巖陀2號(hào)樣品各6份，等量加入槲皮素對(duì)照品，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。槲皮素的平均回收率為96.77%。RSD為1.83%。槲皮素回收率試驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 槲皮素回收率試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果

2.10 耐用性試驗(yàn) 分別采用3支不同品牌的C18色譜柱對(duì)同一巖陀2號(hào)樣品進(jìn)行測(cè)定，槲皮素含量平均值為0.1777 mg/g，RSD為2.38%。表明該方法的耐用性良好。見表4。

表4 耐用性試驗(yàn)結(jié)果

2.11 含量測(cè)定 取各編號(hào)巖陀藥材，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別精密吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液各10 μL，進(jìn)樣測(cè)定，以外標(biāo)法計(jì)算供試品中槲皮素含量，各編號(hào)藥材平行操作3份。見表5。

表5 不同產(chǎn)地不同采收期巖陀藥材中槲皮素的含量（n=3）

3 討論

從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)上看，不同產(chǎn)地相同采收期以及相同產(chǎn)地不同采收期的巖陀藥材中槲皮素的含量相差較大，提示我們?cè)谟盟帟r(shí)應(yīng)注意產(chǎn)地、采收期與藥材質(zhì)量的關(guān)系。相同采收期中以云南鶴慶產(chǎn)地的巖陀含槲皮素最高，貴州水城的較低；同一產(chǎn)區(qū)不同采收月份槲皮素的含量大小順序?yàn)椋?月＞8月＞7月＞10月＞6月＞3月。根據(jù)測(cè)定結(jié)果，可初步確定巖陀的最佳采收時(shí)期為秋季，即7月開始采收，10月結(jié)束，其中9月槲皮素的含量最高。

本實(shí)驗(yàn)以甲醇-0.5%磷酸溶液（50∶50）為流動(dòng)相，槲皮素峰可以達(dá)到基線分離，峰形對(duì)稱，分離度好，采用370 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)，可以和藥材中其它雜質(zhì)峰分離完全，得到的峰純度值較高。本法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，方法學(xué)考察均符合要求。

本課題組一直致力于巖陀藥材的開發(fā)研究，對(duì)該藥材的指紋圖譜、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、巖白菜素提取工藝優(yōu)化及其含量測(cè)定等都有相應(yīng)研究。本實(shí)驗(yàn)建立巖陀藥材中槲皮素的含量測(cè)定方法為該藥材多指標(biāo)成分的檢測(cè)控制提供科學(xué)依據(jù)，對(duì)該藥材的實(shí)際開發(fā)研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。巖陀藥材中巖白菜素和槲皮素的含量變化趨勢(shì)在不同產(chǎn)地不同采收期的情況下是否趨于一致，有待下一階段的研究。

〔1〕王燕，金楊，劉振琪.巖陀中巖白菜素提取工藝優(yōu)化的探索〔J〕.大理學(xué)院學(xué)報(bào)，2012，11（9）：8-11.

〔2〕金楊，王燕.正交試驗(yàn)優(yōu)選復(fù)方巖白菜素滴丸制備工藝〔J〕.中國(guó)藥房，2011，22（7）：614-615.

〔3〕王燕，鮑家科，金楊，等.巖陀藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究〔J〕.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011，17（10）：85-88.

〔4〕張麗艷，李燕，楊玉琴，等.貴州虎耳草的質(zhì)量對(duì)比研究〔J〕.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2010，16（18）：57-59.

〔5〕夏從龍，段新瑜，何華斌，等.民族藥巖陀藥材中巖白菜素的高效液相色譜定量分析〔J〕.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2009，20（2）：289-290.

〔6〕施貴榮，李冬梅，劉光明.西南鬼燈檠的化學(xué)成分研究〔J〕.大理學(xué)院學(xué)報(bào)，2008，7（4）：1-2.

〔7〕謝梅林，顧振綸，錢曾年.槲皮素的抗活性氧作用〔J〕.中國(guó)野生植物資源，1997，2（1）：9.

〔8〕蔡正軍，但飛軍，王威，等．超聲提取鬼燈擎中巖白菜素的最佳工藝研究〔J〕．中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)雜志，2009，26（7）：559-561.

〔9〕丁家欣，張立石，張玲，等.虎耳草提取物對(duì)前列腺癌細(xì)胞凋亡的影響〔J〕.中國(guó)中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)雜志，2005，12（11）：106-107.

〔10〕Petrick T.A DFT study of reactivity of OH group in quercetin and taxifolin antioxidants：the specificity of 3-OH site〔J〕.Food Chemistry，2006，97：679-688.