孟祥科，孫陽(yáng)，屈菲，姜志強(qiáng)，毛明光，李艷秋，吳洪

(1.大連海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧大連116023;2.遼寧出入境檢驗(yàn)檢疫局通關(guān)處，遼寧大連116001)

近年來(lái)，隨著魚(yú)粉價(jià)格的升高，用植物性蛋白作為魚(yú)粉的替代品得到廣泛關(guān)注［1-2］，但是植物蛋白中存在的多種抗?fàn)I養(yǎng)因子嚴(yán)重阻礙了水產(chǎn)動(dòng)物對(duì)于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的有效利用［3］。植酸廣泛存在于植物性原料中，是一種抗?fàn)I養(yǎng)因子，它能夠無(wú)選擇性地螯合蛋白，抑制一些酶的活力包括蛋白酶、胰蛋白酶和α-淀粉酶等。魚(yú)類(lèi)養(yǎng)殖試驗(yàn)已證明［4-7］，植酸能夠降低磷的利用率，影響魚(yú)類(lèi)的生長(zhǎng)、體組成和飼料效率。植酸在大多數(shù)加工過(guò)程中不容易被去除，而添加植酸酶可以水解飼料中的植酸和植酸鹽，促進(jìn)動(dòng)物對(duì)磷的吸收，減少磷排放，改善動(dòng)物生長(zhǎng)性能。

近年來(lái)，隨著畜禽動(dòng)物飼料中植酸酶應(yīng)用研究的逐漸深入，水產(chǎn)動(dòng)物飼料中添加植酸酶的研究報(bào)道也相繼增加。研究表明，飼料中添加植酸酶能顯著改善點(diǎn)帶石斑魚(yú)［4］、真鯛［5］、大西洋鮭［6］等魚(yú)類(lèi)的生長(zhǎng)及飼料效率，但飼料中添加植酸酶對(duì)紅鰭東方鲀Takifugu rubripes生長(zhǎng)性能及飼料利用等的研究目前卻鮮見(jiàn)報(bào)道。紅鰭東方鲀營(yíng)養(yǎng)豐富、肉味鮮美，是一種名貴的海水魚(yú)類(lèi)。本研究中，以紅鰭東方鲀幼魚(yú)為試驗(yàn)對(duì)象，在以添加豆粕降低魚(yú)粉用量的基礎(chǔ)上添加不同水平的植酸酶，研究植酸酶對(duì)東方鲀幼魚(yú)生長(zhǎng)、消化酶及消化率的影響，以期為植酸酶在紅鰭東方鲀飼料中的合理利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用紅鰭東方鲀幼魚(yú)購(gòu)自大連富谷水產(chǎn)有限公司。試驗(yàn)用植酸酶購(gòu)自山東濰坊蘇柯漢生物工程有限公司 (酶活力為5 000 U/g)。試驗(yàn)共制作6組飼料。對(duì)照組D1，全魚(yú)粉蛋白組;對(duì)照組D2，以豆粕替代30%魚(yú)粉蛋白組;試驗(yàn)組S1～S4，在豆粕替代30%魚(yú)粉蛋白基礎(chǔ)上設(shè)4個(gè)不同的植酸酶添加水平 (500、1 000、1 500、2 000 U/kg)。植酸酶活性定義為:在37℃、pH為5.5反應(yīng)條件下，從5.0 mmol/L植酸鈉溶液中每分鐘釋放1 μmol/L無(wú)機(jī)正磷酸根所需植酸酶的量為1個(gè)酶活力單位 (U)。

主要原料經(jīng)粉碎研磨后過(guò)80目網(wǎng)篩，混合均勻后用制粒機(jī)擠壓成軟顆粒飼料，飼料規(guī)格隨魚(yú)的生長(zhǎng)階段而定。飼料分批制作:試驗(yàn)初期飼料粒徑為1 mm;待幼魚(yú)平均體質(zhì)量為10～20 g時(shí)調(diào)整粒徑為2 mm;幼魚(yú)平均體質(zhì)量大于20 g后再調(diào)整粒徑為3 mm。制成的飼料于冰箱 (-20℃)中保存?zhèn)溆?。試?yàn)飼料的組成及營(yíng)養(yǎng)成分見(jiàn)表1。

表1 試驗(yàn)飼料營(yíng)養(yǎng)成分Tab.1 The ingredients and appromimate composition of the experimental diets(dry matter)

1.2 方法

1.2.1 飼養(yǎng)管理 試驗(yàn)幼魚(yú)先暫養(yǎng)20 d，期間投喂魚(yú)糜，之后投喂基礎(chǔ)飼料馴養(yǎng)10 d，待幼魚(yú)完全適應(yīng)養(yǎng)殖環(huán)境后開(kāi)始正式試驗(yàn)。試驗(yàn)設(shè)6組，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)，在18個(gè)200 L藍(lán)色方形水槽中，分別投放初始體質(zhì)量為 (4.58±0.05)g的幼魚(yú)20尾。每天8:00和16:00投喂。投喂量以接近飽食為準(zhǔn)。投飼半小時(shí)后吸底清除殘餌。飼養(yǎng)期間采用流水養(yǎng)殖，水流流速約為3 L/min，24 h微充氣。

試驗(yàn)在大連海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，飼養(yǎng)期為60 d。養(yǎng)殖期間水溫為20～24℃，溶解氧＞5 mg/L，pH為8.0±0.1，鹽度為32.6±0.2。

1.2.2 樣品的收集 60 d飼養(yǎng)期結(jié)束后，停食24 h，從每個(gè)水槽中隨機(jī)取5尾魚(yú)，測(cè)定其體長(zhǎng)、體質(zhì)量等，然后在冰盤(pán)上解剖，迅速剪取肝胰臟、前腸中段，并用4℃預(yù)冷生理鹽水沖洗干凈，置于超低溫冰箱 (-80℃)中保存?zhèn)溆谩?/p>

在投喂試驗(yàn)飼料飼養(yǎng)20 d，試驗(yàn)魚(yú)生活狀態(tài)穩(wěn)定后開(kāi)始收集糞便。每次投喂后吸凈槽底殘餌，4～5 h后用虹吸法收集糞便，置于培養(yǎng)皿中于70℃下烘干，待測(cè)。糞便樣品連續(xù)收集15 d。

1.2.3 測(cè)定及計(jì)算方法

1)生長(zhǎng)指標(biāo)。試驗(yàn)魚(yú)特定生長(zhǎng)率 (SGR)、飼料系數(shù) (FCR)、蛋白質(zhì)效率 (PER)、存活率的計(jì)算公式如下:

存活率 (%)=存活尾數(shù)/總尾數(shù)×100，

其中:W0、Wt為試驗(yàn)魚(yú)的初始體質(zhì)量 (g)和終末體質(zhì)量 (g);t為試驗(yàn)時(shí)間 (d);C為攝餌量(g);Cp為蛋白質(zhì)攝入量 (干質(zhì)量，g)。

2)形體指標(biāo)。試驗(yàn)魚(yú)的肝體比 (HSI)、臟體比 (VSI)、肥滿度 (CF)計(jì)算公式如下:

HSI(%)=肝臟質(zhì)量/魚(yú)體質(zhì)量×100，

VSI(%)=內(nèi)臟質(zhì)量/魚(yú)體質(zhì)量×100，

CF=W/L3×100，

其中:W為試驗(yàn)魚(yú)體質(zhì)量(g);L為試驗(yàn)魚(yú)長(zhǎng)度(cm)。

3)粗酶液的制備。將存放于-80℃下的肝胰臟和腸組織樣品在4℃下解凍，剪碎，按1 g組織加入9 mL生理鹽水的比例加入預(yù)冷的生理鹽水，在玻璃勻漿器中勻漿，粗酶液于4℃下以10 000 r/min離心10 min，取上清液備用。

用蛋白質(zhì)試劑盒 (考馬斯亮蘭法)測(cè)定組織勻漿蛋白質(zhì)含量。

采用福林-酚試劑法測(cè)定蛋白酶活力，其活性單位定義為:在37℃條件下，每分鐘水解酪素所產(chǎn)生1 μg酪氨酸為一個(gè)酶活力單位 (U)。

用脂肪酶試劑盒 (比濁法)測(cè)定脂肪酶活性，其活性單位定義為:在37℃條件下，每克組織蛋白在本反應(yīng)體系中與底物反應(yīng)1 min，每消耗1 μmol底物為一個(gè)酶活力單位 (U)。

4)表觀消化率。采用Cr2O3指示劑法測(cè)定消化率，飼料中指示劑摻入量為0.5%，采用濕式灰化定量法測(cè)定飼料和糞便中的Cr2O3含量。養(yǎng)分物質(zhì)消化率 (D)和飼料干物質(zhì)消化率 (D')的計(jì)算公式如下:

其中:A'和A分別為餌料和糞便中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量;B和B'分別為餌料和糞便中的Cr2O3的含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示，采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行方差分析和Duncan多重比較，顯著性水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果

2.1 植酸酶對(duì)紅鰭東方鲀幼魚(yú)生長(zhǎng)性能的影響

由表2可以看出:經(jīng)過(guò)60 d的飼養(yǎng)試驗(yàn)后，各組紅鰭東方鲀幼魚(yú)成活率沒(méi)有顯著差異 (P＞0.05);相對(duì)于對(duì)照組D1，不同處理的豆粕替代30%魚(yú)粉蛋白組 (D2，S1～S4)幼魚(yú)的終末體質(zhì)量、SGR、PER等均顯著降低 (P＜0.05)，F(xiàn)CR明顯升高 (P＜0.05);相對(duì)于D2組，試驗(yàn)組 (S1～S4)幼魚(yú)的生長(zhǎng)性能整體提高，當(dāng)植酸酶添加水平≥1 000 U/kg時(shí)，幼魚(yú)的終末體質(zhì)量、SGR明顯提高 (P＜0.05)，而FCR則顯著降低 (P＜0.05)。

表2 植酸酶對(duì)紅鰭東方鲀幼魚(yú)生長(zhǎng)性能的影響Tab.2 Effects of dietary phytase on growth performance in juvenile redfin puffer Takifugu rubripes

2.2 植酸酶對(duì)紅鰭東方鲀幼魚(yú)形體指標(biāo)的影響

由表3可以看出:與D1組相比，D2組幼魚(yú)HSI顯著升高 (P＜0.05);與D2組相比，添加植酸酶對(duì)紅鰭東方鲀幼魚(yú)HSI、VSI、CF均未產(chǎn)生顯著影響 (P＞0.05)。

表3 植酸酶對(duì)幼魚(yú)肝體比、臟體比及肥滿度的影響Tab.3 Effects of dietary phytase on hepato-somatic index(HSI)，viscera-somatic index(VSI)and condition factor(CF)in juvenile redfin puffer Takifugu rubripes

2.3 植酸酶對(duì)紅鰭東方鲀幼魚(yú)消化酶活力的影響

由表4可以看出:與D1組相比，豆粕替代30%魚(yú)粉蛋白后肝胰臟蛋白酶活力明顯降低 (P＜0.05)。隨植酸酶添加量的增加，幼魚(yú)肝胰臟蛋白酶活力呈增加趨勢(shì)，當(dāng)植酸酶添加量為1 000、1 500、2 000 U/kg時(shí)，肝胰臟中的蛋白酶活力較D2組顯著升高 (P＜0.05)。本研究結(jié)果表明，添加植酸酶能明顯提高幼魚(yú)腸道蛋白酶活力，且植酸酶添加量為1 000、1 500 U/kg時(shí)，幼魚(yú)腸道蛋白酶活力較D2組分別提高20.33%、16.51%。

與D2組相比，添加植酸酶對(duì)各組幼魚(yú)肝胰臟脂肪酶活力未產(chǎn)生顯著影響 (P＞0.05);隨植酸酶的添加，幼魚(yú)腸道脂肪酶活力呈先升高后降低的趨勢(shì)，在植酸酶添加水平為1 500 U/kg時(shí)達(dá)到最高，與D1組差異不顯著(P＞0.05)，但與D2組差異顯著 (P＜0.05)。

各組幼魚(yú)腸道淀粉酶活力隨植酸酶添加量的增加呈先升高后降低的趨勢(shì)，在植酸酶添加量為500 U/kg時(shí)達(dá)到最高，與 D1組差異不顯著 (P＞0.05)，但與D2組差異顯著 (P＜0.05);添加植酸梅對(duì)幼魚(yú)肝胰臟淀粉酶活性未產(chǎn)生顯著影響(P＞0.05)。

表4 植酸酶對(duì)紅鰭東方鲀幼魚(yú)消化酶活力的影響Tab.4 Effects of dietary phytase on digestive enzyme activities in juvenile redfin puffer Takifugu rubripes U/g

2.4 植酸酶對(duì)紅鰭東方鲀幼魚(yú)消化率的影響

由表5可知:紅鰭東方鲀幼魚(yú)對(duì)干物質(zhì)及磷消化率較低，而對(duì)蛋白質(zhì)和脂肪的消化率較高。添加植酸酶對(duì)幼魚(yú)干物質(zhì)消化率未產(chǎn)生顯著影響 (P＞0.05)，但隨植酸酶添加量的增加，干物質(zhì)消化率呈升高的趨勢(shì)，且在1 000 U/kg處達(dá)到最大值;植酸酶添加量為1 000 U/kg時(shí)，蛋白質(zhì)消化率較D2組顯著提高(P＜0.05);植酸酶添加量為1 000、1 500 U/kg時(shí)，脂肪消化率較D2組顯著提高(P＜0.05);添加植酸酶后，磷消化率較D2組顯著增加(P＜0.05)，植酸酶添加水平為500、1 000、1 500、2 000 U/kg時(shí)，磷消化率較D2組分別提高 39.55%、47.60%、56.89%、46.79%。

表5 植酸酶對(duì)紅鰭東方鲀幼魚(yú)消化率的影響Tab.5 Effects of dietary phytase on digestibility in juvenile redfin puffer Takifugu rubripes %

3 討論

3.1 植酸酶水平對(duì)紅鰭東方鲀生長(zhǎng)性能的影響

有研究資料表明［4-8］，在水產(chǎn)動(dòng)物飼料中添加適量的植酸酶，可以提高其生長(zhǎng)性能，促進(jìn)其生長(zhǎng)。植酸酶對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物的作用因試驗(yàn)動(dòng)物種類(lèi)、植酸酶的含量以及飼料成分等的差異，研究結(jié)果各有不同。馬恒甲等［7］在低磷全植物性蛋白草魚(yú)基礎(chǔ)飼料中添加植酸酶的試驗(yàn)結(jié)果表明，添加大于1 000 U/kg的植酸酶可以明顯提高草魚(yú)的特定增長(zhǎng)率、蛋白轉(zhuǎn)化率，并顯著降低餌料系數(shù)。陳新宇等［8］在研究植酸酶對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)性能的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，在總磷含量為1.6%，植酸磷含量為0.3%，非植酸磷含量為1.3%的基礎(chǔ)飼料中添加500～2 000 U/kg的植酸酶，對(duì)其增重率、飼料利用率和存活率均無(wú)顯著影響，作者分析原因，可能是其試驗(yàn)基礎(chǔ)飼料中的磷含量已經(jīng)能滿足凡納濱對(duì)蝦正常的生長(zhǎng)需求。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，與D2組相比，飼料中添加1 000 U/kg的植酸酶，能顯著提高紅鰭東方鲀幼魚(yú)的生長(zhǎng)性能，證實(shí)了酸性植酸酶在紅鰭東方鲀配合飼料中應(yīng)用的可行性。通過(guò)本試驗(yàn)結(jié)果推測(cè)，試驗(yàn)組幼魚(yú)的磷需求量要大于基礎(chǔ)飼料中所提供的總磷水平 (1.47%)。

幼魚(yú)消化系統(tǒng)發(fā)育不及成魚(yú)完善，可能會(huì)對(duì)各種外界因子尤其是餌料因子變化的反應(yīng)較敏感［9］，尤其是肉食性魚(yú)類(lèi)對(duì)餌料蛋白要求高，若飼料中植物蛋白明顯增加時(shí)，可能會(huì)對(duì)消化系統(tǒng)發(fā)育產(chǎn)生一定影響，肝體比會(huì)發(fā)生較大變化。本試驗(yàn)中，D2組肝體比與D1組相比明顯增加，這與莊平等［10］和Kaushik等［11］研究豆粕替代魚(yú)粉蛋白的試驗(yàn)結(jié)果一致。這可能是飼料中豆粕比例較高時(shí)，某些抗?fàn)I養(yǎng)因子 (如植酸、皂苷、低聚糖類(lèi)等)的存在，引起肝臟消化酶的分泌增加［12］，加重了肝臟代謝負(fù)擔(dān)，導(dǎo)致肝臟代償性增大。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，植酸酶對(duì)紅鰭東方鲀幼魚(yú)HSI、VSI、CF指標(biāo)沒(méi)有顯著影響，但隨植酸酶添加量的增加，肝體比有一定的降低，但S1～S4組均與D1組差異不顯著，說(shuō)明飼料中添加植酸酶對(duì)防止肝臟腫大，降低肝臟負(fù)荷有一定作用，但效果不明顯。

3.2 植酸酶對(duì)紅鰭東方鲀幼魚(yú)消化酶活力的影響

魚(yú)類(lèi)消化酶活力受諸多因素影響，其中包括飼料組成［13］，植物性原料中的植酸對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物分泌的消化酶如淀粉水解酶、脂肪酶、蛋白水解酶等的活性均有抑制作用。添加植酸酶可以解除植酸對(duì)消化酶的抑制作用［14］，促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收。

紅鰭東方鲀?yōu)槿馐承贼~(yú)類(lèi)，喜歡攝入蛋白質(zhì)和脂類(lèi)含量較高的食物，而且極為貪食，對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)有較高的消化和吸收能力。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，所有試驗(yàn)組肝胰臟及腸道蛋白酶活力均較高，且腸道蛋白酶活力高達(dá)1 302.62～1 741.29 U/g;相比D2組，試驗(yàn)組 (S1～S4)幼魚(yú)肝胰臟及腸道蛋白酶活力整體提高，表明植酸酶能提高紅鰭東方鲀幼魚(yú)肝胰臟及腸道蛋白酶活力，這與朱麗英［15］關(guān)于植酸酶對(duì)異育銀鯽生長(zhǎng)、內(nèi)源酶的影響，姚瑞清等［16］關(guān)于植酸酶對(duì)奧尼羅非魚(yú)生長(zhǎng)、表觀消化率與消化酶活性的影響，以及張璐等［17］關(guān)于植酸酶和非淀粉多糖酶對(duì)鱸生長(zhǎng)和消化酶活性的影響等的研究結(jié)果相似。

呂林蘭等［18］關(guān)于植酸酶對(duì)異育銀鯽的研究結(jié)果顯示，添加1 000～1 500 U/kg的植酸酶能提高肝胰臟和腸道脂肪酶的活性。王楓［19］在對(duì)金鱒的研究中發(fā)現(xiàn)，植酸酶的添加導(dǎo)致金鱒腸道和肝胰臟脂肪酶活性略有降低，但差異不顯著。本試驗(yàn)結(jié)果與上述研究結(jié)果不同:添加植酸酶雖然提高了紅鰭東方鲀幼魚(yú)腸道脂肪酶活力，但是未對(duì)其肝胰臟脂肪酶活力產(chǎn)生明顯影響，這可能與肝胰臟脂肪酶主要以酶源的形式儲(chǔ)存在肝胰臟中未被激活有關(guān)，具體原因有待進(jìn)一步探究。

本試驗(yàn)中，各組肝胰臟及腸道淀粉酶活力均較低，很好地反映了紅鰭東方鲀的食性特點(diǎn)。植酸酶添加量為500 U/kg時(shí)，腸道道淀粉酶活力達(dá)到最高，隨添加量繼續(xù)增加活力依次降低。相關(guān)研究顯示，淀粉酶活力會(huì)因食物中某些金屬離子濃度的提高而受到明顯抑制［20］。本試驗(yàn)中，由于植酸酶在紅鰭東方鲀幼魚(yú)消化道內(nèi)，阻礙了植酸與蛋白質(zhì)的結(jié)合，并大量釋放與植酸結(jié)合的金屬離子，導(dǎo)致某些金屬離子濃度過(guò)高，抑制了腸道淀粉酶活力，因此，會(huì)呈現(xiàn)腸道淀粉酶活力先升高后降低的趨勢(shì)。這與牛繼峰等［21］對(duì)大口黑鱸的研究結(jié)果一致。

3.3 植酸酶對(duì)紅鰭東方鲀幼魚(yú)消化率的影響

研究表明，當(dāng)飼料中植物性蛋白質(zhì)含量過(guò)高時(shí)，會(huì)顯著降低魚(yú)類(lèi)的飼料利用率［22］。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，與D1組相比，D2、S1～S4組紅鰭東方鲀幼魚(yú)生長(zhǎng)性能及消化率明顯降低 (P＜0.05)，這與宋理平等［23］對(duì)寶石鱸及陳京華等［24］對(duì)牙鲆的研究結(jié)果相似。

植酸分子中的堿性磷酸基團(tuán)能與蛋白質(zhì)中質(zhì)子化的氨基酸、金屬離子結(jié)合生成螯合物，使蛋白質(zhì)發(fā)生沉淀而降低其利用率及消化酶活力，從而影響飼料的利用率。磷是魚(yú)類(lèi)生長(zhǎng)所必須的營(yíng)養(yǎng)元素之一［25］，植酸酶的添加可以打開(kāi)飼料中植酸的磷酸磷脂鍵釋放出無(wú)機(jī)磷，提高磷的利用率，同時(shí)消除與植酸結(jié)合的蛋白質(zhì)，有利于動(dòng)物對(duì)其消化吸收。

關(guān)于植酸酶對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物消化能力的影響，已有一些報(bào)道。宋理平等［23］研究顯示，一定濃度的植酸酶可以明顯提高寶石鱸的干物質(zhì)、蛋白質(zhì)、脂肪、鈣、磷的表觀消化率。舒秋艷等［26］指出，飼料中添加植酸酶可以一定程度上提高青魚(yú)粗蛋白質(zhì)、粗脂肪、粗灰分及鈣表觀消化率。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，飼料中添加植酸酶可提高紅鰭東方鲀干物質(zhì)、蛋白質(zhì)、脂肪、磷消化率，表明植酸酶對(duì)其營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的利用有一定促進(jìn)作用。因此，飼料中添加適量的植酸酶可以改善紅鰭東方鲀的營(yíng)養(yǎng)利用率，降低磷排放，節(jié)約飼料成本。

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