李文艷 彭梅

甲氨蝶呤(methotrexate，MTX)是一種二氫葉酸還原酶抑制劑，目前廣泛用于治療兒童淋巴性白血病、淋巴瘤和骨肉瘤等惡性腫瘤。甲氨蝶呤的體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)個(gè)體差異大，毒性大，監(jiān)測(cè)其血藥濃度有重要意義，為臨床安全用藥提供指導(dǎo)。目前測(cè)定甲氨蝶呤的方法主要有微生物法、熒光偏振免疫法、高效液相色譜法。筆者根據(jù)南昌市第一醫(yī)院藥劑科現(xiàn)有試驗(yàn)條件，建立高效液相色譜法測(cè)定血漿中甲氨蝶呤濃度，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 儀器與試藥

Agilent HPLC 1260型高效液相色譜儀(美國(guó)安捷倫公司)；；OpenLAB CDS ChemStation 化學(xué)工作站；Mettler-Toledo(FE20)pH計(jì)；TGL-16G高速離心機(jī)(上海)；甲氨蝶呤對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：100138-201104)；甲醇為色譜純；高氯酸、醋酸為分析純；水為重蒸水。

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18柱(4.6×150 mm，5 μm)流動(dòng)相：醋酸(pH=2.86)-甲醇(82.5：17.5)；流速：0.8 ml/min；柱溫：40℃；檢測(cè)波長(zhǎng) 306nm。

2.2 對(duì)照品的配制 精密稱了MTX對(duì)照品50.10 mg置50 ml溶量瓶中加磷酸緩沖鹽定容至刻度，得1020μg/ml的對(duì)照儲(chǔ)存液，置于4℃冰箱保存。使用時(shí)精密吸取適量對(duì)照液配制成所需濃度。

2.3 血漿樣品的預(yù)處理 取血漿樣品1 ml，分別置于5 ml離心管中，加入160 μl濃度為20%高氯酸液，沉淀血漿中的蛋白質(zhì)，渦懸混勻1 min，高速度離心(10000 r/min)5 min．。取上清液0.6 ml置于2 ml離心管中，加入20 μl濃度為0.5 mol/L氫氧化鈉溶液，渦懸混勻1 min，取30 μl進(jìn)樣，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算樣品含量。

2.4 專屬性考察 在本實(shí)驗(yàn)條件下空白血清，MTX標(biāo)準(zhǔn)品血清樣品，經(jīng)高效液相色譜法測(cè)定，得到的色譜圖，峰形尖銳且分離良好(R＞1.5)，血清中內(nèi)源性成分對(duì)其測(cè)定均無(wú)干擾。MTX的保留時(shí)間為：10.18 min。高效液相色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 血漿樣品色譜圖

2.5 線性關(guān)系考察 將對(duì)照液儲(chǔ)存液用血漿按梯度稀釋成10.20μg/ml，3.06μg/ml，1.02μg/ml，0.306μg/ml，0.102μg/ml，0.03μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)血漿溶液，按“2.3”項(xiàng)處理，“2.1”項(xiàng)色譜條件測(cè)定峰面積。以MTX溶液的嘗試對(duì)峰面積作線性回歸(n=5)得回歸方程：y=0.0146x+0.0004(濃度：0.03～1020μg/ml)，r=1。最低檢測(cè)限 0.03μg/ml(S/N=3)，最低定量限：0.306μg/ml(S/N=10)

結(jié)果表明MTX在0.03～10.20μg/ml有良好的性線關(guān)系。最低檢測(cè)限 0.03μg/ml(S/N=3)，最低定量限：0.306μg/ml(S/N=10)。

2.6 精密度試驗(yàn) 配制高中低不同濃度(0.306μg/ml，1.02μg/ml，3.06μg/ml)MTX 血漿各 3 份。按“2.3”項(xiàng)平行操作，得日內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差(RSD)，連續(xù)測(cè)定3 d得平均日間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差(RSD)(見(jiàn)表1)。高、中、低濃度的平均日內(nèi)日間RSD均＜有5%。

2.7 回收率實(shí)驗(yàn) 取“2.6”項(xiàng)下3種濃度的標(biāo)準(zhǔn)血樣各3份，按“2.3”項(xiàng)方法處理后進(jìn)樣分析，記錄樣品峰面積A1，用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品濃度，與加入的實(shí)際濃度比較，得本方法的回收率；同時(shí)取與各濃度標(biāo)準(zhǔn)血樣相同標(biāo)示量的水溶液直接進(jìn)樣，記錄MTX峰面積A2，計(jì)算各濃度樣品提取回收率：提取回收率=A1/A2×100%，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 MTX的日內(nèi)、日間變異和回收率實(shí)驗(yàn)

3 討論

本文參考有關(guān)文獻(xiàn)在樣品的處理和流動(dòng)相的選擇上進(jìn)行優(yōu)化［1-5］，選用高氯酸做蛋白沉淀劑，為提高回收率將其濃度提高到20%；在上清液中加入氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值［3-4］保護(hù)色譜儀。有文獻(xiàn)報(bào)道血清經(jīng)高氯酸處理后，在MTX附近會(huì)出現(xiàn)雜峰，且無(wú)法與目標(biāo)峰分離，建議在樣本經(jīng)處理后須在30 min內(nèi)上機(jī)檢測(cè)［1］，但本試驗(yàn)方法處理后的血漿樣品性質(zhì)穩(wěn)定，并未影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)藥品用色譜柱Agilent ZorbaxSB-C18柱分離時(shí)峰形嚴(yán)重拖尾，換用不同流動(dòng)相并不能改善拖尾現(xiàn)象，而改用Agilent Eclipse XDB-C18柱后峰形尖銳、無(wú)拖尾峰存在，流動(dòng)相不用緩沖鹽也能得到較好峰形。

本試驗(yàn)建立的HPLC法檢測(cè)限低、保留時(shí)間適宜、線性范圍廣，重現(xiàn)性好。用于測(cè)定血漿中甲氨蝶呤的質(zhì)量濃度，所需樣本量少，色譜條件穩(wěn)定，操作簡(jiǎn)單，成本低廉，可用于臨床血藥濃度監(jiān)測(cè)和藥物動(dòng)力學(xué)的研究。

［1］ 許耕川，袁向亮，沈立松，等．HPLC法測(cè)定血清甲氨蝶呤濃度的方法建立及其與熒光偏振法的比較．檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2010，25(9)：701-704.

［2］ 李惠芬，許俐．高效液相色譜法測(cè)定甲氨蝶呤血藥濃度．天津醫(yī)藥，2003，31(7)：446-447.

［3］ 李碧峰，馮惠平，賈晉蓉，等．反相高效液相色譜法測(cè)定血漿中甲氨蝶呤的質(zhì)量濃度．中國(guó)農(nóng)業(yè)，2010，19(19)：7-8.

［4］ 唐麗紅．HPLC法測(cè)定宮外孕患者血清中甲氨蝶呤的濃度．海峽藥學(xué)．2003，1(1)：101-103.

［5］ 王?。委熕幬锉O(jiān)測(cè)．北京：人民軍醫(yī)出版社，2011：220-224.