馮鮑盛 白玉 劉虎威

(北京大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院 北京100871)

俗語說“一畫勝千言”。一張圖片可以很好地幫助人們理解非常復(fù)雜的道理。科學(xué)研究領(lǐng)域也是如此，圖像可以幫助我們更好地、更直觀地理解其背后的深奧科學(xué)原理以及相應(yīng)的實驗結(jié)果。因而，成像技術(shù)及其應(yīng)用是目前科研領(lǐng)域的一個非常熱門的研究方向。比如，在醫(yī)院診斷中運用非常成熟的磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)、正電子發(fā)射計算機斷層顯像(positron emission computed tomography，PET)和計算機斷層掃描(computed tomography，CT)以及在實驗室中經(jīng)常使用的熒光成像、原子力顯微鏡(atomic force microscope，AFM)和掃描隧道顯微鏡(scanning tunnel microscope，STM)等。商品化的MRI等技術(shù)可以直接對人體的組織進行無創(chuàng)的快速成像，但是其分辨率較低，只有1mm3～1cm3［1-2］。相比之下，熒光成像則可以達到非常高的分辨率［3］。由于熒光成像通常需要對目標分析物進行標記，因而會改變被分析物所處的原始環(huán)境，并可能造成標記后物質(zhì)分布與標記前有所區(qū)別，從而不利于原位的分析和檢測。AFM和STM兩種技術(shù)雖然可以直接進行原子級別分辨率的成像，但它們不能對被測物質(zhì)本身進行定性的分析［4］。

質(zhì)譜成像(mass spectrometry imaging，MSI)是將成像處理軟件與質(zhì)譜的離子掃描技術(shù)相結(jié)合的一種新型成像方法。相對于傳統(tǒng)的成像方法，質(zhì)譜成像具有免熒光標記、不需要復(fù)雜樣品前處理、可以提供豐富的被分析物空間分布信息等優(yōu)點。與核磁共振或者正電子發(fā)射計算機斷層顯像相比，質(zhì)譜成像有更高的空間分辨率;而相對于熒光成像，質(zhì)譜成像所需的樣品前處理步驟相對簡單，而且不需要熒光標記，避免了可能引起的樣品原始狀態(tài)的改變。質(zhì)譜技術(shù)可以根據(jù)被分析物的不同質(zhì)荷比，分析從小分子到生物大分子等物質(zhì);結(jié)合成像技術(shù)，可以直觀地給出較高分辨率的被分析物空間分布情況。因此，質(zhì)譜成像技術(shù)越來越多地受到人們的關(guān)注，成為成像研究領(lǐng)域的一個新熱點。

1 質(zhì)譜成像技術(shù)及常壓敞開式離子化質(zhì)譜技術(shù)

質(zhì)譜成像通?？梢园凑召|(zhì)譜分析所用的離子化方法進行分類。目前較為成熟的質(zhì)譜成像商用儀器有兩種:二次離子質(zhì)譜(secondary ion mass spectrometry，SIMS)以及基質(zhì)輔助激光解吸質(zhì)譜(matrixassisted laser desorption/ionization mass spectrometry，MALDI-MS)。SIMS和MALDI-MS都屬于解吸型離子化質(zhì)譜(圖1)。SIMS是在高真空環(huán)境中，利用高能初級離子束(例如Ar+、Au3+、等)轟擊樣品表面［5］，使得樣品表面的一部分物質(zhì)被解吸下來并離子化，產(chǎn)生的次級離子再進入質(zhì)量分析器，進而被檢測分析。SIMS可以達到目前質(zhì)譜成像中最高的空間分辨率——幾十納米［6］，但由于其初級離子束能量較高，易產(chǎn)生碎片離子，其質(zhì)量分析范圍約2000kDa左右，對于大分子的檢測靈敏度不高，因而其目前主要用于小分子化合物的質(zhì)譜成像研究。MALDI是2002年獲得諾貝爾獎的新型離子化方法，可以對生物蛋白質(zhì)大分子進行離子化，大大拓寬了質(zhì)譜的分析范圍，也為質(zhì)譜成像帶來了新的可能。在MALDI-MS離子化過程中發(fā)揮最重要作用的是基質(zhì)。在非成像的MALDI-MS分析過程中，被分析物和過量的基質(zhì)混合共結(jié)晶，基質(zhì)的量是被分析物的103～105倍［7］。MALDI的解吸和離子化是一個非常復(fù)雜的過程，基質(zhì)吸收激光的能量，與被分析物共同解吸附到氣相中，此過程中同時發(fā)生質(zhì)子轉(zhuǎn)移反應(yīng)，使分析物在氣相中帶上電荷，進而進入質(zhì)量分析器進行檢測。在MALDI-MS成像過程中，首先需要在樣品表面均勻噴涂上基質(zhì)溶液。除了作為基質(zhì)外，該溶液還可原位地將被分析物從樣品中萃取，進而進行質(zhì)譜分析［8］。MALDI-MS成像在質(zhì)譜成像領(lǐng)域中的應(yīng)用越來越廣泛，但基質(zhì)的噴涂可能造成小分子化合物以及蛋白質(zhì)等待分析物的擴散和移位現(xiàn)象，此外，成像分辨率受限于激光光斑直徑大小和共結(jié)晶的直徑大小，一般在20μm左右［9-10］?；|(zhì)的使用易對中低相對分子質(zhì)量化合物的MALDI-MS成像造成干擾。

圖1 MALDI-MS(A)和SIMS(B)原理示意圖［8］

SIMS和MALDI-MS兩種質(zhì)譜成像技術(shù)的發(fā)展都較為成熟，且均有商品化儀器。它們的質(zhì)譜掃描過程均需要在高真空條件下進行，無法進行實時原位的分析。隨著2004年常壓敞開式離子化質(zhì)譜概念的提出［11］，各種各樣的常壓敞開式離子化技術(shù)紛紛涌現(xiàn)出來，為質(zhì)譜成像技術(shù)的進一步發(fā)展提供了新的技術(shù)支持。

常壓敞開式離子化技術(shù)主要有以下幾方面特點［12］:①離子化過程在常壓或者開放環(huán)境中進行;②無需或者只需簡單的樣品前處理;③可以和絕大多數(shù)的商品化質(zhì)譜儀結(jié)合;④電離方式軟，產(chǎn)生的碎片較少。根據(jù)文獻報道，目前已經(jīng)有幾十種常壓敞開式離子化方法。按照離子化過程和作用機理，大體可以分為以下幾類［12-14］:1)基于噴霧和固液萃取的離子化技術(shù):解吸電噴霧電離(desorption electrospray ionization，DESI)，探針電噴霧電離(probe electrospray ionization，PESI)，納噴霧解吸電噴霧電離(nanospraydesorption electrospray ionization，nanoDESI)，萃取電噴霧電離(extractive electrospray ionization，EESI)，簡易敞開式聲波噴霧電離(easy ambient sonic spray ionization，EASI);2)基于等離子體的離子化技術(shù):實時直接分析(direct analysis in real time，DAＲT)，低溫等離子體(low-temperature plasma，LTP)，解吸電暈束電離(desorption corona beam ionization，DCBI);3)基于激光解吸消融的離子化技術(shù):紅外激光消融亞穩(wěn)誘導(dǎo)化學(xué)離子化(infrared laser ablation metastable-induced chemical ionization，IＲ-LAMICI))，電噴霧激光解吸電離(electrospray laser desorption ionization，ELDI)，激光消融電噴霧電離(laser ablation electrospray ionization，LAESI)，基質(zhì)輔助激光解吸電噴霧電離(matrix-assisted laser desorption electrospray ionization，MALDESI);4)基于聲波解吸的離子化技術(shù):激光誘導(dǎo)聲波解吸電噴霧電離(laser-induced acoustic desorption-electrosprayionization，LIAD-ESI)，射頻聲波解吸電離(radio-frequency acoustic desorption and ionization，ＲADIO)。

目前已經(jīng)報道的用于質(zhì)譜成像的常壓敞開式離子化方法還不多。下面將對其進行詳細的討論。

2 常壓敞開式離子化質(zhì)譜成像

2.1 解吸電噴霧電離質(zhì)譜成像

解吸電噴霧電離(desorption electrospray ionization，DESI)是第一種被報道的常壓敞開式離子化技術(shù)［11］，也是目前常壓敞開式離子化質(zhì)譜成像領(lǐng)域研究最多的一種方法。

DESI是一種常壓、常溫、敞開式、原位、基本不需要樣品前處理也不需要基質(zhì)輔助的可以分析小分子和生物大分子的軟電離技術(shù)［15］。如圖2所示，在霧化氣的帶動下，溶劑在高壓下形成電噴霧，并以一定角度吹掃樣品表面;在與樣品表面的分子接觸過程中，將部分被分析物分子溶解，并且形成次級帶電液滴束;次級帶電液滴束以合適的角度噴入質(zhì)譜入口，進而進行檢測和分析。由于DESI基本不需要樣品前處理或者額外的基質(zhì)輔助就可以對待測物質(zhì)進行檢測，因而可將其用于樣品的原位檢測。但截至目前，DESI仍存在一些不足，如不同的電噴霧溶劑組成對樣品表面分子的溶解和電離存在一定的選擇性;此外，DESI成像的分辨率受其噴霧空間分辨率的限制，一般約為200μm。雖有報道可以通過優(yōu)化實驗條件將分辨率提高至40μm左右［16］，但與SIMS和MALDI-MS相比，分辨率仍較低。DESI作為一種新型的常壓敞開式離子化技術(shù)，過去幾年里在質(zhì)譜成像領(lǐng)域已有諸多應(yīng)用，如法醫(yī)鑒定、組織成像、代謝物分析及三維組織成像分析等。

圖2 DESI的原理示意圖［11］

Ifa等人［17］報道了利用DESI-MS進行字跡鑒定以及成像方法的研究，他們采用逐行掃描的方式對樣品數(shù)據(jù)進行采集，并利用成像軟件將結(jié)果分析匯總得出成像結(jié)果。進而利用這一方法進行了筆跡［18］以及犯罪現(xiàn)場指紋［19］的質(zhì)譜成像研究(圖3)。Dill等人［20］報道了利用DESI-MS成像研究腫瘤細胞及胸腺組織切片上脂質(zhì)的不同分布。Manicke等人［21］將高分辨的軌道阱質(zhì)譜(orbitrap-MS)與DESI聯(lián)用，對小鼠大腦的脂質(zhì)進行了質(zhì)譜成像，并比較了不同脂質(zhì)的分布區(qū)別。Watrous等人［22］利用DESI-MS對枯草桿菌和鏈霉菌的二次代謝產(chǎn)物進行成像分析，為藥物開發(fā)中天然產(chǎn)物的發(fā)現(xiàn)提供了新的有效途徑。Lane等人［23］則報道了熱帶藻類組織表面的抗菌物質(zhì)分布情況，為進一步研究其生理功能提供了基礎(chǔ)。

圖3 DESI指紋成像研究［19］

除了可以進行常規(guī)的二維成像分析，DESI-MS還可以對生物組織進行三維成像。Cooks等人利用該方法報道了小鼠腦中的脂質(zhì)類化合物分布的三維質(zhì)譜成像結(jié)果(圖4)［24］。首先選擇一片組織切片，確定了小鼠腦中的兩種特征離子(m/z834.4為PS 18:0/22:6，m/z 888.8為ST 24:1)。然后將小鼠大腦組織切成36片，對每個切片分別進行成像，再將結(jié)果疊加起來，得到完整的三維小鼠大腦質(zhì)譜成像圖，證明了DESI-MS三維成像的可能性，并據(jù)此研究了小鼠大腦的特征物質(zhì)分布情況。

圖4 小鼠大腦DESI三維成像結(jié)果［24］

2.2 其他常壓敞開式離子化質(zhì)譜成像研究

2.2.1 低溫等離子體質(zhì)譜成像

低溫等離子體(low-temperature plasma，LTP)［25］是一種新型的常壓敞開式離子化技術(shù)，原理如圖5所示。氣體在電場放電作用下產(chǎn)生低溫的等離子體，進而噴射到樣品表面，使待測物質(zhì)解吸并離子化。LTP的溫度一般為30℃，載氣為He、Ar或空氣。其特點是對樣品的損傷小，溫度低，產(chǎn)生的離子碎片少。張新榮等人［26］報道了利用LTP低溫?zé)o損等分析特點，對藝術(shù)品上的印章油墨成分進行質(zhì)譜成像分析，實驗中優(yōu)化的成像掃描速度為270μm/s，等離子體直徑為150μm。選取m/z71、83和116三個離子作為特征離子，對藝術(shù)品的真品和贗品進行了對比分析。

2.2.2 激光消融電噴霧電離質(zhì)譜成像

Nemes等人［27］報道了一種將激光和ESI結(jié)合的新型常壓敞開式離子化方法——激光消融電噴霧電離(laser ablation electrospray ionization，LAESI)。其實驗所用到的激光為波長2940nm的紅外激光，能量為3.5mJ，直徑為350μm;ESI部分利用甲醇-水溶液(V(甲醇):V(水)=1:1)形成的電噴霧。其原理是被分析物先被激光消融解吸后再由電噴霧進行離子化并進入質(zhì)量分析器進行檢測(圖6)。LAESI不需要任何的樣品前處理過程，其質(zhì)量檢測范圍涵蓋了小分子到大分子，方法檢測限為8fmol。方法的不足之處在于要求被分析體系含有一定量的水分。Nemes等人［28］利用LAESI-MS對富含水分的生物組織樣品(例如小鼠大腦)進行了質(zhì)譜成像;并利用LAESI的300μm二維空間分辨率和30～40μm的深度分辨率，將不同深度的獨立二維成像結(jié)果相疊加，從而得到了三維的組織成像結(jié)果［29］。

圖5 LTP-MS［25］

圖6 LAESI-MS原理示意圖［27］

2.2.3 紅外激光消融亞穩(wěn)誘導(dǎo)化學(xué)電離

Fernandez等人［30］報道了常壓敞開式離子化技術(shù)——紅外激光消融亞穩(wěn)誘導(dǎo)化學(xué)電離(infrared laser ablation metastable-induced chemical ionization，IR-LAMICI)，原理如圖7所示。首先是用紅外激光脈沖轟擊樣品表面，將其表面的分子消融并解吸;解吸下來的被分析物和處于激發(fā)態(tài)的亞穩(wěn)態(tài)氣體分子相互作用而離子化。利用激光有效提高質(zhì)譜的空間分辨率，該裝置可以較好地對小分子進行成像分析。利用IR-LAMICI-MS對藥片進行質(zhì)譜成像分析的結(jié)果見圖8。

2.2.4 探針電噴霧電離質(zhì)譜成像

圖7 IR-LAMICI-MS原理示意圖［30］

圖8 IR-LAMICI-MS對藥片中乙酰氨基苯酚單體(m/z=152)和二聚體(m/z=303)的質(zhì)譜成像［30］

Hiraoka等人［31］報道了利用固體探針實現(xiàn)電噴霧的常壓敞開式離子化方法——探針電噴霧電離(probe electrospray ionization，PESI)。PESI離子化方法利用電動馬達驅(qū)動可上下豎直移動的固體探針，探針首先下降并接觸樣品，樣品表面或內(nèi)部的物質(zhì)(視下降深度而定)粘附到探頭上，從而完成采樣。當(dāng)探針上升到固定位置，在其上加3kV高壓，從而在探針的尖端產(chǎn)生電噴霧，進而進入質(zhì)量分析器進行檢測。其原理如圖9所示。Chen等人［32］報道了利用PESI對液體被分析物進行分析，對小鼠大腦組織進行了磷脂的質(zhì)譜成像研究等。由于PESI的分辨率取決于探針尖端的直徑大小，因此，實驗利用很細的探針達到了60μm的高空間分辨率。

2.2.5 納噴霧解吸電噴霧電離質(zhì)譜成像

Laskin等人［33］報道了一種新型的常壓敞開式離子化方法——納噴霧解吸電噴霧電離(nanospray desorption electrospray ionization，nanoDESI)。其原理如圖10所示，溶劑在初始毛細管和噴霧毛細管間形成液橋并接觸樣品表面，從而將被分析物從樣品表面萃取出來。被分析物和溶劑在電場作用下，在噴霧毛細管中形成電噴霧，進而進入質(zhì)譜進行檢測與分析。Laskin等人［34］利用nanoDESI進行了質(zhì)譜成像研究(其空間分辨率可以達到12μm)，并利用該裝置對小鼠大腦的脂類分布進行了研究。

圖9 PESI原理示意圖［31］

圖10 nanoDESI原理示意圖及其空間分辨率研究［34］

3 總結(jié)與展望

經(jīng)過幾十年的發(fā)展，質(zhì)譜成像已經(jīng)成為成像研究領(lǐng)域的新熱點。質(zhì)譜成像的優(yōu)點是在提供研究對象空間分布信息的同時，可以提供其豐富的分子結(jié)構(gòu)信息，并且不需要對被分析物進行標記，也不需要復(fù)雜的樣品前處理過程。更重要的是，成像分析之前不需要對被分析樣品有很多的了解，是一種探索發(fā)現(xiàn)型的研究方法。現(xiàn)代質(zhì)譜儀器的迅猛發(fā)展，為質(zhì)譜成像提供了多種可供選擇的離子化方法，以及具有更高分辨率、靈敏度以及分析速度的新型質(zhì)譜儀，使得質(zhì)譜成像技術(shù)成為病理學(xué)、生物化學(xué)以及制藥分析等領(lǐng)域的有力工具。質(zhì)譜成像通過給出被分析物的結(jié)構(gòu)和分布信息，幫助人們認識重大疾病等研究過程中的問題和現(xiàn)象，有潛力成為實際醫(yī)學(xué)應(yīng)用等領(lǐng)域的常規(guī)分析方法。

截至目前，質(zhì)譜成像技術(shù)仍有很多問題需要解決。例如成像的分辨率、靈敏度以及適用范圍的進一步提高;規(guī)范化、快速的樣品前處理方法的開發(fā);質(zhì)譜成像分析過程中自動化程度的提高;有效快捷的數(shù)據(jù)處理以及存儲方案等。由于常壓敞開式離子化技術(shù)可以實現(xiàn)真正意義上的原位分析，為質(zhì)譜成像領(lǐng)域帶來了新的發(fā)展;但目前成像的空間分辨率、靈敏度和重復(fù)性等都有待于進一步提升，這也是相關(guān)科技人員面臨的挑戰(zhàn)。

［1］LewellenTK.PhysMedBiol，2008，53:R287

［2］ZierhutML，Ozturk-IsikE，ChenAP，etal.JMagnResonImaging，2009，30:473

［3］GiepmansBNG，AdamsSR，EllismanMH，etal.Science，2006，312:217

［4］CourjonD，BainierC.RepProgPhys，1994，57:989

［5］WeibelD，WongS，LockyerN，etal.AnalChem，2003，75:1754

［6］SlodzianG，DaigneB，GirardF，etal.BiolCell，1992，74:43

［7］WoodsA.S，JacksonSN.AAPSJ，2006，8:E391

［8］ChughtaiK，HeerenRMA.ChemRev，2010，110:3237

［9］AerniHR，CornettDS，CaprioliRM.AnalChem，2006，78:827

［10］SchwartzSA，ReyzerML，CaprioliRM.JMassSpectrom，2003，38:699

［11］TakatsZ，WisemanJM，GologanB，etal.Science，2004，306:471

［12］HarrisGA，GalhenaAS，F(xiàn)ernandezFM.AnalChem，2011，83:4508

［13］WestonDJ.Analyst，2010，135:661

［14］AlbericiRM，SimasRC，SanvidoGB，etal.AnalBioanalChem，2010，398:265

［15］IfaDR，WuCP，OuyangZ，etal.Analyst，2010，135:669

［16］KerteszV，VanBerkelGJ.RapidCommunMassSpectrom，2008，22:2639

［17］IfaDR，WisemanJM，SongQY，etal.IntJMassSpectrom，2007，259:8

［18］IfaDR，GumaeliusLM，EberlinLS，etal.Analyst，2007，132:461

［19］IfaDR，ManickeNE，DillAL，etal.Science，2008，321:805

［20］DillAL，IfaDR，ManickeNE，etal.JChromatogrB，2009，877:2883

［21］ManickeNE，DillAL，IfaDR，etal.JMassSpectrom，2010，45:223

［22］WatrousJ，HendricksN，MeehanM，etal.AnalChem，2010，82:1598

［23］LaneAL，NyadongL，GalhenaAS，etal.ProcNatlAcadSciUSA，2009，106:7314

［24］EberlinLS，IfaDR，WuC，etal.AngewChemIntEd，2010，49:873

［25］HarperJD，ChariparNA，MulliganCC，etal.AnalChem，2008，80:9097

［26］LiuYY，MaXX，LinZQ，etal.AngewChemIntEd，2010，49:4435

［27］NemesP，VertesA.AnalChem，2007，79:8098

［28］NemesP，WoodsAS，VertesA.AnalChem，2010，82:982

［29］NemesP，BartonAA，VertesA.AnalChem，2009，81:6668

［30］GalhenaAS，HarrisGA，NyadongL，etal.AnalChem，2010，82:2178

［31］HiraokaK，NishidateK，MoriK，etal.RapidCommunMassSpectrom，2007，21:3139

［32］ChenLC，YoshimuraK，YuZ，etal.JMassSpectrom，2009，44:1469

［33］RoachPJ，LaskinJ，LaskinA.Analyst，2010，135:2233

［34］LaskinJ，HealthBS，RoachPJ，etal.AnalChem，2012，84:141