王惟 李丹 劉微

隨著成分輸血的開(kāi)展，冰凍解凍去甘油紅細(xì)胞是用甘油作為冷凍劑低溫冰凍保存紅細(xì)胞制劑的一種方法，是在緊急情況下，能夠及時(shí)搶救Rh陰性的患者，近年來(lái)臨床應(yīng)用受到重視，它是一種低溫保存紅細(xì)胞很有效的方法［1］。早在60年代，就已建立了冰凍紅細(xì)胞低溫保存技術(shù)，因?yàn)闇囟容^低的狀態(tài)下，紅細(xì)胞代謝會(huì)逐漸降低，或者細(xì)胞代謝活動(dòng)停止。這樣紅細(xì)胞能量的消耗也降低，紅細(xì)胞的一些代謝產(chǎn)物也會(huì)隨之降低，使紅細(xì)胞處在休眠狀態(tài)。冷凍血是其它制劑所不能替代的制劑，長(zhǎng)達(dá)十年的保存期［2］。使Rh陰性血的來(lái)源得到保障。為患者搶救爭(zhēng)取了保貴時(shí)間。目前紅細(xì)胞冷凍保護(hù)劑應(yīng)用的是復(fù)方甘油溶液。由于甘油滲透壓較高，人體輸入過(guò)量甘油會(huì)造成細(xì)胞溶血，給患者造成極大損害。所以為了更好提高冰凍解凍去甘油紅細(xì)胞的質(zhì)量，作者在制備時(shí)采用手洗梯度洗滌法來(lái)制備，在紅細(xì)胞制備、保存、解凍洗滌過(guò)程中積累一些經(jīng)驗(yàn)，現(xiàn)和大家分享一下。

1 材料與方法

1.1 試劑與耗材 57%復(fù)方甘油溶液、9%氯化鈉溶液、三珠冷凍袋、無(wú)菌四聯(lián)袋(北京博德桑特輸采血器材科技開(kāi)發(fā)中心)、羥乙基淀粉溶液(濟(jì)南三九益民制藥公司)、0.9%生理鹽水(吉林康乃爾公司)、振蕩器(HY-4金壇市)、無(wú)菌接駁機(jī)(SC-203A泰爾)、恒溫水浴箱(余姚市東方電工儀器廠)、-80℃速凍冰箱(三洋)、離心機(jī)(賀利氏6000I)。

1.2 冰凍紅細(xì)胞制備方法 加入甘油，將保存期6d內(nèi)的全血或紅細(xì)胞懸液離心，2200 r/min，25 min，去除上清后，將紅細(xì)胞用無(wú)菌接駁機(jī)與三珠袋相接，并轉(zhuǎn)移至三珠袋中加甘油，動(dòng)作一定要輕柔，避免對(duì)紅細(xì)胞造成人為損傷。200 ml紅細(xì)胞需加甘油160 ml，加甘油滴速必須控制，先慢后快，前5 min甘油滴速為40滴/min左右，5 min后甘油滴速可以控制為80滴/min，20 min滴加完畢。振蕩器的頻率為60次/min，振幅為5 cm。甘油化的紅細(xì)胞盡量減少人為移動(dòng)，需要在室溫靜止30 min，30 min后送-80℃速凍冰箱速凍待用，保存一個(gè)月以上方可應(yīng)用。

1.3 洗脫甘油 取出保存在-80℃速凍冰箱內(nèi)的冰凍紅細(xì)胞，在37～42℃水浴箱內(nèi)融化，融化時(shí)間為每袋4～5 min，水浴箱內(nèi)的水要沒(méi)過(guò)血袋，融化完成，取出在室溫下靜止5 min，用無(wú)菌接駁機(jī)連接空袋，在4℃條件下，2300r/min離心8min后去除上清，然后用無(wú)菌接駁機(jī)與輸血器下端連接，輸血器上端連接9%NaCl溶液(80 ml)，滴速先慢后快，前2 min滴速為20～30滴，2 min后滴速調(diào)至50～60滴/min，7 min加完。靜止5 min后，加入羥乙基淀粉溶液100 ml，滴速控制在40～50滴/min，靜止5 min后，再加入0.9%氯化鈉溶液50 ml后，開(kāi)始離心，2300轉(zhuǎn)8 min去除上清后，加入0.9%氯化鈉溶液150 ml，勻速加入，60～80滴/min。以上在往冰凍紅細(xì)胞加入溶液時(shí)均需在振蕩下完成，振蕩器的頻率為60次/min，振幅為5 cm。連續(xù)洗滌三次，制備成冰凍解凍去甘油紅細(xì)胞。

1.4 在制備過(guò)程中加甘油后不同放置時(shí)間和洗脫時(shí)不同離心力對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量有較大影響，按照這兩項(xiàng)條件不同將制備的產(chǎn)品分A組和B組。

1.5 質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn) 上清血紅蛋白不超過(guò)1 g/L;殘余甘油含量在10 g/L;紅細(xì)胞回收率 ＞80%;體外溶血實(shí)驗(yàn)≤50%［3］。

2 結(jié)果

2.1 甘油化時(shí)紅細(xì)胞加甘油后不同放置時(shí)間，A組15 min，B組30 min，檢測(cè)甘油殘留量，A組甘油殘留量:7.85±0.65(g/L);B組甘油殘留量:(4.49±0.92)(g/L)。每組各8袋。兩組相比P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 在洗脫甘油過(guò)程中，適當(dāng)?shù)碾x心力既能很好地去除甘油，又能減少重離心對(duì)紅細(xì)胞的破壞，作者采用不同離心力制備冰凍紅細(xì)胞后檢測(cè)冰凍紅細(xì)胞各項(xiàng)參數(shù)，做如下比較，A組2600轉(zhuǎn)/min，B組3300轉(zhuǎn)/min，見(jiàn)表1。

表1 洗脫甘油過(guò)程中兩種離心力的對(duì)比

3 討論

冰凍解凍去甘油紅細(xì)胞主要用于Rh陰性血的長(zhǎng)期保存，以及為自身輸血?jiǎng)?chuàng)造條件［4］。能極大緩解供需緊張的矛盾。自從本站開(kāi)展冰凍解凍去甘油紅細(xì)胞技術(shù)以來(lái)，為臨床患者提供很大方便。但是在手工制備過(guò)程中，一些微小的細(xì)節(jié)應(yīng)該引起制備者的注意。①滴速問(wèn)題，先慢后快的滴速對(duì)紅細(xì)胞膜的刺激作用會(huì)變小一些，讓紅細(xì)胞膜內(nèi)外的環(huán)境在逐漸變化，以免因?yàn)闈B透壓作用造成對(duì)紅細(xì)胞膜的損害。②加入甘油后的成品，三珠袋內(nèi)的空氣一定要排凈，因?yàn)檠鼉?nèi)微小的空氣氣泡聚集在一起形成大氣泡，會(huì)破壞紅細(xì)胞膜，極易造成溶血。③在-80℃速凍冰箱取出的冰凍紅細(xì)胞，盡量減少在室溫的放置時(shí)間，在加入甘油后要保證靜止時(shí)間。④離心問(wèn)題，經(jīng)過(guò)多次選擇離心力，試驗(yàn)證明，離心力大小很影響冰凍紅細(xì)胞的質(zhì)量，過(guò)大離心力會(huì)對(duì)紅細(xì)胞造成不可逆轉(zhuǎn)的損傷。對(duì)于加入甘油冰凍保存長(zhǎng)達(dá)十年紅細(xì)胞來(lái)說(shuō)，保護(hù)紅細(xì)胞膜十分重要。⑤振蕩器的振幅和頻率也很重要，必須保持在有效范圍內(nèi)，振幅5 cm，頻率60次/min。⑥臨床應(yīng)用冰凍解凍去甘油紅細(xì)胞經(jīng)過(guò)去甘油的反復(fù)洗滌，去除了細(xì)胞代謝產(chǎn)物，以及大部分的白細(xì)胞、血小板、血漿蛋白，能大大減少輸血反應(yīng)。能為臨床患者提供高質(zhì)量的冷凍血。

［1］ 邱艷．全血成分血質(zhì)量要求與血液標(biāo)準(zhǔn)化．北京:中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2002:72-73．

［2］ 王培華．輸血技術(shù)學(xué)．北京:人民衛(wèi)生出版社，2002:70-73．

［3］ 中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)．全血及成分血質(zhì)量要求GB18469-2001．

［4］ 安萬(wàn)新，于衛(wèi)建．輸血技術(shù)學(xué)．北京:科學(xué)技術(shù)文獻(xiàn)出版社，2010:167．