王金華 宋秋苓 宋光耀

小牛血去蛋白提取物(Deproteined Extract of Calf Blood，DECB)是一種幼牛靜脈血去蛋白質(zhì)后所得的小分子混合物，其主要作用為改善細(xì)胞能量代謝［1］。小牛血去蛋白凝膠是DECB系列的外用制劑，它是DECB加適宜基質(zhì)配制而成，主要用于皮膚燒燙傷、潰瘍等治療，但其作用機(jī)理仍不十分清楚。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立大鼠的深I(lǐng)I度燒傷模型，以基質(zhì)凝膠作對(duì)照，探討小牛血去蛋白凝膠對(duì)大鼠燒傷創(chuàng)面愈合的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 體重200～250 g的斯普拉-道來(lái)(氏)(Sprague-Dawley，SD)大鼠，由遼寧醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供；小牛血去蛋白凝膠、基質(zhì)凝膠(卡波姆)購(gòu)自遼寧省錦州奧鴻藥業(yè)有限公司，羥脯氨酸試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.2 動(dòng)物模型制備、分組及處理 SD大鼠，腹腔內(nèi)注射3%戊巴比妥鈉30 mg/kg，脫毛；次日同方法麻醉后，背部于80℃熱水里燙15s，制成面積約為10%深I(lǐng)I度燒傷模型。燒傷后的大鼠單籠飼養(yǎng)并隨機(jī)分為A、B、C三組，每組20只。A組為自然愈合組，B組為基質(zhì)凝膠組，創(chuàng)面外用基質(zhì)凝膠，厚度為2～3 mm，每日換藥一次，C組為小牛血去蛋白凝膠組，用法同 B 組。各組隨機(jī)取 10 只大鼠于燙傷后 1、3、5、7、10、14、21 d活取創(chuàng)面組織標(biāo)本，余下10只用做大體觀察。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.3.1 HOP含量測(cè)定 應(yīng)用化學(xué)比色法，具體操作按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.3.2 成纖維細(xì)胞平均密度計(jì)數(shù)和毛細(xì)血管截面面數(shù)密度創(chuàng)面組織，10%的甲醛固定，逐級(jí)酒精脫水，石蠟包埋，切片HE染色。隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野(HPF)對(duì)毛細(xì)血管、成纖維細(xì)胞進(jìn)行定量分析。

2 結(jié)果

2.1 燒傷創(chuàng)面HOP含量的變化 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，創(chuàng)面HOP含量隨著修復(fù)時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸升高，在第14天達(dá)到峰值，隨后又逐漸降低。A、B兩組創(chuàng)面HOP含量在傷后不同時(shí)間的差異無(wú)顯著性；傷后7、10、14 d，C組創(chuàng)面HOP含量顯著高于B組(P＜0.01)；在其他時(shí)間，各組創(chuàng)面HOP的含量比較差異無(wú)顯著性(P＞0.05)。(見(jiàn)表1)

表1 燒傷后各組創(chuàng)面的HOP含量隨時(shí)間變化情況(±s，n=10，μg/mg蛋白)

表1 燒傷后各組創(chuàng)面的HOP含量隨時(shí)間變化情況(±s，n=10，μg/mg蛋白)

注：與A組相比，★P＜0.05，★★P＜0.01；與B組相比，▲P＜0.05，▲▲ P＜0.01

images/BZ_228_237_2321_2245_2420.pngA組 1.43±0.39 1.49±0.47 1.72±0.25 2.01±0.22 2.28±0.27 2.71±0.24 2.53±0.41 B組 1.28±0.43 1.51±0.35 1.87±0.22 2.12±0.29 2.15±0.26 2.82±0.35 2.60±0.38 C組 1.23±0.56 1.58±0.24 2.05±0.46 2.78±0.34★★▲▲ 3.04±0.31★★▲▲ 3.76±0.43★★▲▲2.81±0.23

表2 傷后不同時(shí)間創(chuàng)面成纖維細(xì)胞平均密度計(jì)數(shù)(±s，n=50，個(gè)/HPF)

表2 傷后不同時(shí)間創(chuàng)面成纖維細(xì)胞平均密度計(jì)數(shù)(±s，n=50，個(gè)/HPF)

注：與 A 組相比，★P＜0.05，★★P＜0.01；與 B組相比，▲P＜0.05，▲▲P ＜0.01

images/BZ_228_237_2740_1199_2839.pngA組29.81±3.2 56.57±4.3 83.48±4.8 B組 31.25±4.6 55.82±3.7 86.79±3.4 C組 46.38±4.1★★▲▲ 108.64±5.2★★▲▲ 118.93±4.2★★▲▲

2.2 成纖維細(xì)胞平均密度計(jì)數(shù) 傷后7、14、21 d，三組的成纖維細(xì)胞均呈增加趨勢(shì)。B組略高于A組，但差異無(wú)顯著性；C組明顯高于B組(P＜0.01)。(見(jiàn)表2)

表3 傷后不同時(shí)間創(chuàng)面毛細(xì)血管截面數(shù)密度比較(±s，n=50，個(gè)/HPF)

表3 傷后不同時(shí)間創(chuàng)面毛細(xì)血管截面數(shù)密度比較(±s，n=50，個(gè)/HPF)

注：與A組相比，★P＜0.05，★★P＜0.01；與 B組相比，▲P＜0.05，▲▲P ＜0.01

images/BZ_228_1279_2854_2244_2953.pngA組5.34±2.7 38.24±3.1 58.94±3.6 B組 6.02±2.3 40.37±3.5 57.63±4.2 C組 15.26±3.4★★▲▲ 67.42±2.9★★▲▲ 85.82±4.7★★▲▲

2.3 毛細(xì)血管截面面數(shù)比較 傷后，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，毛細(xì)血管呈增加趨勢(shì)。傷后7、14、21 d，C組毛細(xì)血管數(shù)量明顯多于A、B組(P＜0.01)。B組毛細(xì)血管數(shù)量高于A組，但差異無(wú)顯著性(P＞0.05)。(見(jiàn)表3)

3 討論

燒傷創(chuàng)面愈合是一復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程，包括局部凝血、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)的合成與重塑。其中，細(xì)胞增殖在創(chuàng)面愈合過(guò)程中的作用最為重要，其速度直接影響愈合時(shí)間和愈后質(zhì)量。深Ⅱ度燒傷創(chuàng)面的細(xì)胞增殖主要包括成纖維細(xì)胞增殖和血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，二者在創(chuàng)面愈合的過(guò)程中相互作用，相互影響。一方面，成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的膠原蛋白可通過(guò)影響內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)，影響毛細(xì)血管生成；另一方面，新生毛細(xì)血管的數(shù)量增加，可以為成纖維細(xì)胞的代謝提供能量，加快膠原蛋白的產(chǎn)生。此外，膠原蛋白作為創(chuàng)面基質(zhì)的主要成份，可為表皮細(xì)胞的遷移和增殖提供支架。HOP在膠原中所占比例恒定(大約12.5%)［2］，檢測(cè)HOP含量可間接反映創(chuàng)面膠原的含量。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果：在傷后7、10、14 d，小牛血去蛋白凝膠組創(chuàng)面HOP含量、成纖維細(xì)胞和毛細(xì)血管數(shù)量均明顯高于自然愈合組、基質(zhì)凝膠組，提示小牛血去蛋白凝膠具有促進(jìn)燒傷組織中膠原合成、血管形成及成纖維細(xì)胞增殖作用。

小牛血去蛋白凝膠有明顯促進(jìn)燒傷創(chuàng)面愈合作用，其機(jī)制可能與小牛血去蛋白提取物能夠促進(jìn)缺氧細(xì)胞對(duì)氧和葡萄糖的攝取與利用，改善能量代謝有關(guān)［3-4］。在燒傷早期，小牛血去蛋白提取物能夠改善局部組織細(xì)胞對(duì)氧的利用，促進(jìn)葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝，使細(xì)胞的能量代謝趨于理想狀態(tài)，從而為體內(nèi)一系列再生反應(yīng)提供所必須的能量物質(zhì)，在根本上改變創(chuàng)面及損傷組織由于微循環(huán)中斷而引起的缺氧和供給不足的狀態(tài)。在創(chuàng)面愈合的細(xì)胞增殖期，小牛血去蛋白提取物能激發(fā)毛細(xì)血管形成，促進(jìn)成纖維細(xì)胞的游走和增殖，從而使膠原的合成和積累增加，加速創(chuàng)面上皮化。此外，小牛血去蛋白提取物還能使膠原纖維重組，減少或避免瘢痕的形成。研究表明，小牛血去蛋白提取物可通過(guò)增加線粒體的呼吸能力和高能磷酸的合成，促進(jìn)細(xì)胞對(duì)氧的利用。而小牛血去蛋白提取物促進(jìn)細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取作用可能與其有效成分之一磷酸肌醇寡糖(IPOs)有關(guān)，IPOs能激活細(xì)胞膜上的葡萄糖載體(GluT)，進(jìn)而促進(jìn)葡萄糖向細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)。IPOs除了激活GluT外，還能直接影響與糖代謝途徑中一些酶的活性，如激活丙酮酸脫氫酶，環(huán)腺苷酸磷酸二酯酶和腺苷酸環(huán)化酶，從而促進(jìn)葡萄糖的代謝［5］。

本研究結(jié)果提示，小牛血去蛋白凝膠可以通過(guò)促進(jìn)創(chuàng)面血管內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞增殖及膠原合成，加速燒傷的愈合，為臨床燒燙傷用藥提供參考。

［1］ Buchmayer F，P；einer J，Elmlinger MW，et al．Actovegin?：a biological drug for more than 5 decades．Wien Med Wochenschr，2011，161(3-4)：80-88.

［2］ Dimicco MA，Waters SN，Akeson WH，et al．Integrative urticular cartilage repair：dependence on developmental stage and collagen metabolism．Osteoarthritis and Cartilage，2002，10：218-225.

［3］ Pavlov OO．Effect of actovegin on dynamics of the oxygen methabolism in tissues．Klin Khir，2009，(1)：32-34.

［4］ 周麗敏，于佳胡，林富林等．小牛血去蛋白提取物對(duì)小鼠能量代謝的影響．東南國(guó)防醫(yī)藥，2010，12(2)：104-106.

［5］ Ziegler D，Movsesyan L，Mankovsky B，et al．Treatment of symptomatic polyneuropathy with actovegin in type 2 diabetic patients．Diabetes Care，2009，32(8)：1479-1484.