王 昊 柴 曄 陳慧玲 李志虎 張連生

蘭州大學(xué)第二醫(yī)院血液科，甘肅蘭州 730000

非霍奇金淋巴瘤作為一種惡性腫瘤日益危害著人類的健康，如何治療和提高治療效果成為臨床醫(yī)務(wù)工作者的研究關(guān)鍵。大量的臨床和臨床前期研究表明順鉑 （cisplatinum-diamino-dichloride，DDP）和細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞（cytokine-induced killer，CIK）具有顯著的抗腫瘤作用[1-2]，且治療非霍奇金淋巴瘤具有良好效果[3]。DDP預(yù)處理可以增強(qiáng)CIK細(xì)胞對(duì)部分癌細(xì)胞的殺傷作用[4-6]。本文研究目的主要是通過細(xì)胞體外培養(yǎng)的方法研究經(jīng)順鉑預(yù)處理后，是否可以增強(qiáng)CIK細(xì)胞殺傷淋巴瘤細(xì)胞的殺傷活性，為臨床應(yīng)用化療聯(lián)合CIK細(xì)胞治療非霍奇金淋巴瘤提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

DDP購(gòu)自齊魯制藥（海南）有限公司（批號(hào):A1A1212052）；重組人白介素-2（IL-2）購(gòu)自山東泉港藥業(yè)有限公司（批號(hào):201207003）；γ 干擾素（IFN-γ）購(gòu)自上海凱茂生物有限公司（批號(hào):20121110）；抗CD3單克隆抗體購(gòu)自Bioscience公司（批號(hào):E06304-1633）；CellTraceTMCFSE Cell Proliferation Kit（C34554）購(gòu)自 Invitrogen 公司（批號(hào):1255942）；碘化丙啶 （PI）購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所 （編號(hào)ST511）；RPMI1640購(gòu)自GIBCO公司（批號(hào):1161726）；胎牛血清購(gòu)自浙江天杭生物科技有限公司（批號(hào):121122）；淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自MP公司（批號(hào):V0711A）；流式細(xì)胞儀為美國(guó)BD產(chǎn)品。

1.2 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞

人類非霍奇金淋巴瘤細(xì)胞株Namalwa（Burkitt淋巴瘤細(xì)胞株）、SU-DHL-4（彌漫大B淋巴瘤細(xì)胞株）均購(gòu)自上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院白血病研究室。實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，在37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3天傳代1次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 CIK細(xì)胞體外培養(yǎng)

抽取健康人外周血50 mL，使用密度梯度離心方法分離外周血取得單個(gè)核細(xì)胞，把細(xì)胞濃度調(diào)整為1×106/mL進(jìn)行后續(xù)培養(yǎng)，第1天加入IFN-γ 1000 U/mL，置于37℃，5%CO2，飽和濕度條件下培養(yǎng)24 h，然后分別加入重組人白介素-1（IL-1）100 U/mL、重組人 IL-2（IL-2）500 U/mL、抗CD3單克隆抗體50 ng/mL，在37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。以后每3天半量更換新鮮培養(yǎng)液，并補(bǔ)加重組人IL-2，細(xì)胞密度調(diào)整至1×106/mL，培養(yǎng)期間用流式細(xì)胞儀監(jiān)測(cè)細(xì)胞免疫表型變化。

1.4 四種DDP濃度預(yù)處理后CIK殺傷效果影響

分別向Namalwa細(xì)胞、SU-DHL-4細(xì)胞中加入濃度為0、25、50、75 μg/L 的 DDP 培養(yǎng) 18 h，再加入 CIK 細(xì)胞，CIK細(xì)胞與淋巴瘤細(xì)胞的效靶比為20∶1，用CFSE/PI雙標(biāo)法測(cè)CIK細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的殺傷作用。

1.5 三種DDP時(shí)間預(yù)處理后CIK殺傷效果

分別向Namalwa細(xì)胞、SU-DHL-4細(xì)胞中加入濃度為25 μg/L 的 DDP，再分別培養(yǎng) 18、24、36 h 后，加入 CIK 細(xì)胞，CIK細(xì)胞與淋巴瘤細(xì)胞的效靶比為20∶1，用CFSE/PI雙標(biāo)法測(cè)CIK細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的殺傷作用。

1.6 流式細(xì)胞儀監(jiān)測(cè)CIK細(xì)胞免疫表型變化并檢測(cè)CIK細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的殺傷效果

CIK培養(yǎng)期間用流式細(xì)胞儀監(jiān)測(cè)細(xì)胞免疫表型變化。細(xì)胞樣本采用CFSE/PI雙標(biāo)法進(jìn)行檢測(cè)。分別收集處理后的細(xì)胞樣本上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，取30000～50000個(gè)細(xì)胞進(jìn)行分析。CFSE的熒光強(qiáng)度在流式檢測(cè)時(shí)是用FL1熒光通道檢測(cè)，PI的熒光強(qiáng)度則是通過FL2熒光通道檢測(cè)。CFSE，PI雙陽性的細(xì)胞為被殺傷的靶細(xì)胞，除以靶細(xì)胞總分?jǐn)?shù)，即為殺傷率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次，取4次實(shí)驗(yàn)平均值進(jìn)行分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 15.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CIK細(xì)胞的培養(yǎng)

細(xì)胞換液時(shí)進(jìn)行無菌檢測(cè)（細(xì)菌、真菌、支原體、病毒等），并取少量CIK細(xì)胞培養(yǎng)物加入相應(yīng)檢測(cè)抗體混勻，避光放置25 min后，上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示CIK細(xì)胞在培養(yǎng) 21 d 左右時(shí)，CD3+、CD56+和 CD3+CD8+的細(xì)胞比例均較理想，細(xì)胞活性可保持96%以上，可持續(xù)至25 d左右，所以本實(shí)驗(yàn)選擇培養(yǎng)21 d時(shí)的CIK細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，見圖1。

圖1 殺傷細(xì)胞的免疫表型

2.2 四種DDP濃度預(yù)處理后CIK殺傷效果影響

細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)70%融合時(shí)，分別向Namalwa細(xì)胞、SU-DHL-4細(xì)胞中加入濃度為 0、25、50、75 μg/L 的 DDP 培養(yǎng) 18 h，Namalwa 細(xì)胞死亡率為 0、（2.70±0.35）%、（7.03±1.40）%、（8.450±0.93）% ，SU-DHL-4 細(xì) 胞 死 亡 率 為 0、 （2.30±0.60）%、（5.03±0.84）%、（8.15±0.88）%。加入 CIK 細(xì)胞（與淋巴瘤細(xì)胞的效靶比為20∶1），CIK聯(lián)合四種濃度的DDP殺傷 Namalwa 細(xì) 胞的 殺傷 率為 （14.18±2.38）%、（30.73±2.63）%、（43.78±2.52）%、（51.53±1.98）%，殺傷 SU-DHL-4細(xì)胞的 殺傷 率為 （13.00±3.34）%、（29.00±2.28）%、（41.75±2.62）%、（50.03±0.90）%（圖 2）。結(jié)果顯示，DDP 預(yù)處理濃度增加，CIK殺傷靶細(xì)胞效應(yīng)增強(qiáng)。

圖2 不同濃度順鉑預(yù)處理，殺傷細(xì)胞對(duì)淋巴瘤細(xì)胞的殺傷作用

2.3 三種DDP時(shí)間預(yù)處理后CIK殺傷效果影響

在兩種淋巴瘤細(xì)胞中分別加入25 μg/L的DDP分別培養(yǎng) 18、24、36 h，DDP 對(duì) Namalwa細(xì)胞殺傷率分別為（2.70±0.35）%、（4.47±1.02）%、（5.83±0.78）%，DDP 對(duì) SUDHL-4細(xì)胞的殺傷率分別為（2.30±0.60）%、（3.50±1.17）%、（5.43±0.66）%。加入 CIK 細(xì)胞（與淋巴瘤細(xì)胞的效靶比為20∶1），在不同時(shí)間點(diǎn)，DDP聯(lián)合CIK對(duì)Namalwa細(xì)胞的殺傷效應(yīng)為 （30.73±2.63）%、（40.75±2.33）%、（46.70±3.74）%，對(duì) SU-DHL-4 細(xì)胞的殺傷效應(yīng)為（29.00±2.28）%、（39.35±1.79）%、（42.40±3.04）%。結(jié)果顯示，DDP 作用靶細(xì)胞24 h后，有顯著的靶細(xì)胞死亡。隨著DDP預(yù)處理時(shí)間延長(zhǎng)，再聯(lián)合CIK細(xì)胞，靶細(xì)胞的死亡率增加（圖3）。

圖3 不同時(shí)間DDP預(yù)處理，CIK對(duì)淋巴瘤細(xì)胞的殺傷作用

3 討論

DDP被廣泛應(yīng)用于臨床，但需很高劑量，順鉑的藥理作用才能發(fā)揮，治療過程中會(huì)出現(xiàn)許多不良反應(yīng)，例如惡心、嘔吐、食欲減退、腎及泌尿系損害等[7]。怎樣使化療增效，成為研究者的難題。1991年，一類由多種細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞由斯坦福大學(xué)的Schmidt等[8]首先報(bào)道。長(zhǎng)期大量研究表明CIK細(xì)胞具有可大量增殖、對(duì)多種腫瘤細(xì)胞殺傷活性強(qiáng)大、非MHC限制性、對(duì)自身組織無細(xì)胞毒作用等優(yōu)點(diǎn)[9-10]。CIK為多種細(xì)胞混合體，其殺傷機(jī)制為，CIK細(xì)胞在受到刺激時(shí)，會(huì)釋放以CD3+CD56+雙陽性細(xì)胞為最大顆粒釋放量的具有細(xì)胞毒性的胞質(zhì)顆粒物，作為外源性局部定向的細(xì)胞溶解毒素，通過細(xì)胞膜滲透，直接殺傷腫瘤細(xì)胞。CIK細(xì)胞活化后產(chǎn)生大量炎癥細(xì)胞因子，如TNF-α、IL-2、GM-CSF等，既可直接抑制腫瘤細(xì)胞，又可通過調(diào)節(jié)機(jī)體免疫系統(tǒng)反應(yīng)，間接殺傷腫瘤細(xì)胞。許多腫瘤細(xì)胞表達(dá)FasL，誘導(dǎo)免疫效應(yīng)細(xì)胞凋亡，使免疫治療成功性減低。體外培養(yǎng)過程中，CIK細(xì)胞表達(dá)FasL，可以通過對(duì)FasL陽性腫瘤細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡，長(zhǎng)期慢性殺傷腫瘤細(xì)胞，也對(duì)FasL陽性腫瘤所致的凋亡有對(duì)抗作用[11-13]。

近年來，已有化療聯(lián)合CIK細(xì)胞協(xié)同治療腫瘤的相關(guān)報(bào)道，可提高肺癌、乳腺癌、胃癌、惡性黑色素瘤等的治療效果[4-5，14]。本實(shí)驗(yàn)研究經(jīng)順鉑預(yù)處理后對(duì)CIK細(xì)胞殺傷非霍奇金淋巴瘤細(xì)胞的影響。實(shí)驗(yàn)選取人類NHL細(xì)胞Namalwa細(xì)胞、SU-DHL-4細(xì)胞，經(jīng)不同DDP濃度及時(shí)間預(yù)處理后，發(fā)現(xiàn)CIK殺傷靶細(xì)胞效應(yīng)隨DDP濃度增加、時(shí)間延長(zhǎng)均增強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)顯示低濃度、短時(shí)間DDP對(duì)靶細(xì)胞的殺傷效果欠佳，但聯(lián)合CIK后可使靶細(xì)胞明顯死亡。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，其增效作用可能依賴于機(jī)體T淋巴細(xì)胞。內(nèi)源性T淋巴細(xì)胞群包含兩部分，即腫瘤抑制性及促進(jìn)性亞群。腫瘤抑制性T淋巴細(xì)胞亞群可與CIK細(xì)胞共同抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。DDP預(yù)處理后，可促進(jìn)發(fā)生免疫調(diào)節(jié)性腫瘤抑制作用，并可增強(qiáng)CIK免疫治療療效。Treg為重要腫瘤促進(jìn)性T淋巴細(xì)胞亞群細(xì)胞，DDP預(yù)處理后，腫瘤微環(huán)境中的比例下降，促進(jìn)免疫應(yīng)答發(fā)生，抑制腫瘤生長(zhǎng)[15]。

綜上所述，與單用CIK細(xì)胞治療相比，DDP預(yù)處理后聯(lián)合CIK對(duì)淋巴瘤細(xì)胞更具殺傷作用，可大幅提高腫瘤細(xì)胞的殺傷率。本實(shí)驗(yàn)可進(jìn)行進(jìn)一步研究，更好地為化療聯(lián)合免疫治療的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

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