王 琴，仉紅剛，卡米拉·阿不里米提，張秋菊，修瑞娟

(中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院微循環(huán)研究所，北京100005)

骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic proteins，BMPs)屬于轉化生長因子超家族中的一類成員，它們對于細胞的分化、增殖、遷移、存活等生物學過程中具有重要的調控作用［1－2］。最初的研究認為，BMP-2和BMP-4在間質干細胞的分化以及骨及軟骨的形成及修復過程中骨的形成和血管的形成具有重要作用［3－4］。然而，也有不少的研究結果顯示，BMPs及其受體參與血管發(fā)生(vasculogenesis)和血管新生(angiogenesis)。例如，BMP-4表達缺陷的小鼠，其心臟及脈管系統(tǒng)的發(fā)育異常［5］，敲除了Smad1或Smad5基因的小鼠由于脈管系統(tǒng)發(fā)育不完全而死于胚胎期［6］。另外，BMPs影響小鼠胚胎干細胞來源的內皮細胞及人表皮微血管內皮細胞的增殖和遷移［7］。盡管BMPs對于內皮細胞功能的作用越來越受到研究者們的關注，但是，BMPs，特別是BMP-4對于人臍靜脈內皮細胞成血管能力的影響及其作用機制的研究仍未見報道。故本研究主要分析了BMP-4對于臍靜脈內皮細胞的增殖，遷移，體外成血管能力的影響，并且對于參與其中的分子機制做初步探討。

1 材料與方法

1.1 試劑

無菌PBS，D'Hanks(中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所細胞中心)，Hanks，BrdU細胞增殖檢測試劑盒(Invitrogen公司)，膠原酶Ⅳ，纖維連接蛋白(Sigma公司)，內皮細胞用培養(yǎng)基(Sciencell公司)，細胞因子BMP-4(R＆D Systems公司)，包被小鼠抗人CD31單克隆抗體的免疫磁珠(Miltenyi公司);小鼠抗人VE-cadherin單克隆抗體及TRITC標記的山羊抗小鼠熒光二抗(Santa Cruz公司);基質膠(BD Biosciences公司)，RIPA裂解液，SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(碧云天公司)，BCA定量試劑盒(普利萊公司);兔源抗 phospho ERK1/2一抗，兔源抗 total ERK1/2一抗，辣根過氧化物酶標記的抗兔二抗(Cell Signaling公司)。

1.2 HUVEC的分離與培養(yǎng)

原代分離HUVECs，步驟參照文獻［8］。采用含10%FBS的內皮細胞專用培養(yǎng)基培養(yǎng)。細胞培養(yǎng)于37℃，5%CO2的孵箱中，取3～6代細胞進行實驗。

1.3 HUVECs的純化與鑒定

使用包被小鼠抗人CD31單克隆抗體的免疫磁珠對原代分離的HUVECs進一步純化。以小鼠抗人VE-cadherin單克隆抗體及TRITC標記的山羊抗小鼠熒光二抗鑒定純化后的HUVECs。

1.4 細胞增殖檢測

細胞增殖的檢測采用BrdU法，利用BrdU試劑盒進行，步驟如下:按照5×103個/孔的接種密度將HUVEC接種至96孔板。血清饑餓8 h。分別以不同濃度的 BMP-4(5、10、20、50 和100 ng/mL)處理細胞24 h，每個濃度5個復孔。在BMP-4作用細胞8 h后，加入BrdU，BMP-4作用24 h后，將細胞固定。加入抗BrdU的一抗，室溫，1 h。辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫，30 min。加入辣根過氧化物酶底物，室溫，避光，30 min。酶標儀檢測吸光度。

1.5 劃痕實驗

本實驗用于觀察BMP-4對HUVECs遷移能力的影響。步驟如下:采用包被纖維連接蛋白(10 mg/L)的12孔板培養(yǎng)HUVECs至匯合。使用200 μL黃色槍頭垂直于細胞培養(yǎng)面劃出相互垂直的兩條直線。PBS洗2次，倒置顯微鏡下以兩條劃痕的交點為中心，在5×物鏡下對連續(xù)5個視野進行拍照記錄;干預細胞:在干預前8 h以無血清培養(yǎng)基對細胞進行饑餓處理后，進行干預實驗。對照組:以無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞24 h;BMP-4組:分別以濃度為5、10、20、50 和100 ng/mL的 BMP-4 作用細胞24 h;結晶紫染色HUVECs并在同一位置拍照記錄遷移情況;使用Image-Pro Plus 6.0軟件測定單個視野十字劃痕內的細胞數(shù)以衡量HUVECs的遷移能力。實驗重復3次。

1.6 HUVEC體外成血管能力檢測

本實驗考察BMP-4干預下HUVECs形成血管管腔樣結構的能力。步驟如下:實驗前1 d應把96孔板，200 μL黃色槍頭移至4℃遇冷過夜。實驗前1 d將基質膠自－20℃移至4℃過夜緩慢融化;在冰上以每孔25 μL基質膠包被96孔板;37℃ 30 min使膠凝固;每孔接種5×103個HUVECs，培養(yǎng)基最終體積為100 μL，24 h后觀察各組成管情況，以 HUVECs是否形成血管管腔樣結構衡量其成管能力。實驗重復3次。

1.7 Western blot

細胞長至匯合后，分別以上述濃度的BMP-4處理細胞10 min，RIPA裂解液提取細胞總蛋白，BCA法測定蛋白質濃度，每孔上樣量為30 μg。電泳，恒壓65 V，約40 min時樣品前沿進入分離膠，切換電壓到120 V，直至溴酚藍跑到距膠底沿1.0 cm時終止電泳。采用濕轉法進行轉膜，恒流，86 mA，3 h。

1.8 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 HUVECs的形態(tài)學觀察

HUVECs呈單層貼壁生長，細胞為扁平短梭狀。待細胞匯合后即表現(xiàn)為鵝卵石樣(圖1A)。免疫熒光染色顯示細胞為VE-cadherin陽性，證實細胞確為HUVECs(圖1B)。

2.2 BMP-4對HUVEC增殖能力的影響

與對照組相比，只有在BMP-4濃度是20 ng/mL時，對HUVEC的增殖才有顯著抑制作用。當BMP-4的濃度為50和100 ng/mL，這種抑制作用減弱，HUVEC的增殖能力又恢復到正常水平(圖2)。

2.3 BMP-4對HUVEC遷移的影響

與對照組相比，只在BMP4濃度是20 ng/mL時，對HUVEC的遷移才有顯著抑制作用。當BMP-4濃度為50和100 ng/mL，這種抑制作用減弱，HUVEC的遷移能力又恢復到正常水平(圖3)。

2.4 BMP-4對HUVEC體外成血管能力的影響

圖1 HUVECs的形態(tài)學觀察Fig 1 Morphology of HUVECs(×400)

與對照組相比，只在 BMP-4濃度是20 ng/mL時，對HUVEC的體外成血管能力才有顯著抑制作用。當BMP-4濃度為50和100 ng/mL，這種抑制作用減弱，HUVEC的體外成血管能力又恢復到正常水平(圖4)。

2.5 ERK/MAPK信號通路參與BMP-4對HUVEC成血管能力的影響

與對照組相比，BMP-4在低濃度即 5，10，20 ng/mL時抑制HUVEC ERK/MAPK的活性，但是這種抑制作用只在 BMP4濃度是10 ng/mL與20 ng/mL時具有統(tǒng)計學意義。然而，隨著BMP-4濃度的繼續(xù)升高，即BMP-4的濃度為50，100 ng/mL，這種抑制作用減弱，HUVEC ERK/MAPK活性又恢復到正常水平(圖5)。

3 討論

早期的文獻表明，BMPs在胚胎早期發(fā)育和血管系統(tǒng)的形成過程中具有重要的作用，之后，陸續(xù)有研究關注BMPs對于內皮細胞體外成血管能力的影響［9］。然而，針對BMP-4對于臍靜脈內皮細胞體外成血管能力的影響的研究至今仍很少見。本研究結果表明，BMP-4的濃度在20 ng/mL時，才對HUVECs的成血管能力有顯著抑制作用。然而，當BMP-4的濃度升高至50和100 ng/mL時，這種抑制作用逐漸減弱，并有恢復到正常水平的跡象，這一結果與一些研究結果存在一定的不一致，如BMP-2呈濃度依賴型促進HUVEC的增殖。遷移［10］，盡管BMP-2和BMP-4屬于BMPs家族中同一亞類，但是這種不一致仍然可能與BMP-2和BMP-4的生物學功能存在一定的差異有關。

圖2 BMP-4對HUVEC增殖能力的影響Fig 2 Effects of BMP-4 at different concertrations on HUVEC proliferation

BMPs與受體結合后，Ⅰ型受體被組成型活化的Ⅱ型受體磷酸化，繼而啟動Smad信號級聯(lián)通路。Smad1/Smad5/Smad8被活化的Ⅰ型受體磷酸化后，與co-Smad(Smad4)結合后轉移至細胞核以調控相關基因的表達。然而本研究結果發(fā)現(xiàn)，存在不同于Smad通路以外的其他信號通路參與 BMP-4對HUVEC成血管能力，即ERK/MAPK通路，這一結果與一些研究結果一致，認為 BMPs通過 ERK/MAPK［11－12］通路調節(jié)細胞增殖，分化和凋亡。

圖5 BMP-4對HUVEC ERK1/2的影響Fig 5 Effects of BMP-4 on pERK1/2 expression of HUVECs(±s)

本研究結果顯示，BMP-4在低濃度時具有抑制HUVEC的增殖、遷移和成血管，然而隨著BMP-4濃度的升高，這種抑制作用逐漸減弱，phospho ERK1/2水平的變化趨勢與上述作用一致，故本研究結果提示BMP-4對于HUVEC體外成血管能力的影響可能是通過ERK/MAPK發(fā)揮作用的。此外，有研究認為，BMP-4通過 dual-specificity phosphatase(DUSP)的磷酸酶來調節(jié)phospho ERK1/2的水平［13］。在本研究中，BMP-4 對于phospho ERK1/2水平的調控是否也是通過DUSP家族成員進行的有待進一步探討。

綜上所述，本研究結果表明，BMP-4在低濃度時具有抑制HUVEC的增殖、遷移和成血管，然而隨著BMP-4濃度的升高，這種抑制作用逐漸減弱，并有恢復至正常水平的趨勢，BMP-4對于HUVEC體外成血管能力的影響可能是通過ERK/MAPK發(fā)揮作用的。

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