周蘭英，蔣樂(lè)龍，李定梅，閻 青，于紅纓，姚志軍，向開(kāi)敏

(1.懷化醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，湖南懷化418000;2.懷化市第一人民醫(yī)院，湖南懷化418000;3.中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院，湖南長(zhǎng)沙410013)

乙型肝炎 (hepatitis B，HB)是由乙型肝炎病毒 (hepatitis B virus，HBV)感染機(jī)體后所引起的疾病。乙型肝炎是一個(gè)世界性公共衛(wèi)生問(wèn)題，全球約20億人曾感染過(guò)HBV，其中3.5億人為慢性感染者，我國(guó)的慢性乙肝患者約9 300萬(wàn)人［1］。已有的大量研究證實(shí)，慢性乙肝與多種慢性肝病、肝硬化和肝細(xì)胞癌的發(fā)生有關(guān)，嚴(yán)重危害人類的身體健康［2－4］，有關(guān)慢性乙肝的致病機(jī)制和防治方法的研究是感染性疾病研究中的重點(diǎn)之一［5］。天然免疫是機(jī)體抵抗病毒感染的重要防線，在乙型肝炎病毒感染時(shí)同樣發(fā)揮著重要作用［6－7］。而 Toll樣受體 (Toll-like receptor，TLR)既是天然免疫的重要組成分子，也是聯(lián)系天然免疫與適應(yīng)性免疫的重要紐帶［8］。本研究擬通過(guò)檢測(cè)慢性乙肝患者外周血單個(gè)核細(xì)胞TLR3的表達(dá)以及血清中相關(guān)細(xì)胞因子含量，同時(shí)比較患者體內(nèi)HBV的DNA復(fù)制水平，明確乙型肝炎病毒感染與TLR3表達(dá)之間的聯(lián)系，為探索乙肝病毒的致病機(jī)制提供新的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

選擇2011-03—2012-03在中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院就診的慢性乙肝患者25例，根據(jù)肝穿刺病理結(jié)果及其他臨床資料，參照慢性乙型肝炎防治指南(2010 年版)確診［9］，輕度12 例，中度 10 例，重度3例。其中男性20例，女性5例，年齡范圍:21～53歲，平均年齡34.3歲。根據(jù)患者血清HBeAg的狀態(tài)和HBV拷貝數(shù)將上述患者分為復(fù)制活躍組(HBeAg陽(yáng)性，且 HBV DNA拷貝數(shù) ＞1×105copies/Ml，n=15)和復(fù)制不活躍組(HBeAg陰性，且HBV DNA 拷貝數(shù)介于1×103～1×105copies/mL，n=10)。同時(shí)選擇來(lái)院體檢的健康志愿者25例作為健康對(duì)照組，其中男性20例，女性5例，年齡范圍:20～54歲，平均年齡30.6歲。血清HBsAg及HBV DNA均為陰性，無(wú)心、肝、腎、消化道、代謝異常和神經(jīng)等系統(tǒng)疾病史。

1.2 研究方法

1.2.1 主要試劑:血清HBV DNA檢測(cè)試劑盒(廣州達(dá)安基因股份有限公司);TNF-α、IFN-β ELISA檢測(cè)試劑盒(晶美公司);Ficoll淋巴細(xì)胞分離液(Sigma公司);Trizol及反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega公司)，Taq DNA Polymerase(TaKaRa公司)，引物合成由上海生工完成;小鼠抗人TLR3熒光抗體以及同型對(duì)照抗體(eBioscience公司)，破膜劑(Fix＆Perm)(Beckman公司)。小鼠抗人TLR3抗體、小鼠抗人β-actin多克隆抗體、兔抗小鼠抗體及ECL試劑盒(Santa Cruz公司)。

1.2.2 標(biāo)本采集與保存:所有對(duì)象均于清晨采集空腹靜脈血5 mL，其中3 mL全血加入肝素鈉抗凝管，應(yīng)用Ficoll淋巴細(xì)胞分離液分離PBMC;另2 mL全血不抗凝，在小試管中自然凝血后收集血清，取100 μL血清在30 min內(nèi)進(jìn)行HBV DNA檢測(cè)，其余血清于－70℃保存待用。

1.2.3 血清HBV DNA檢測(cè):采用熒光定量PCR法，按照試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行，該試劑盒的最低敏感度為1×103copies/mL，本研究中慢性乙肝患者的血清HBV DNA拷貝數(shù)均高于此數(shù)值。患者血清HBeAg的情況依據(jù)門(mén)診檢驗(yàn)結(jié)果。

1.2.4 TLR3 mRNA表達(dá)檢測(cè):將采集到的PBMC用PBS洗滌1次后，調(diào)細(xì)胞濃度至106個(gè)/mL，取1 mL細(xì)胞懸液以Trizol法抽提總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以得到的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，TLR3擴(kuò)增引物:上游引物:5'-GCTGGAAAATCTCCAAGAGC-3'，下游引物:5'-CTTCCAATTGCGTGAAAACA-3';擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為159 bp;以β-actin為內(nèi)對(duì)照，擴(kuò)增引物:上游引物:5'-GGGAAATCGTGCGTGACAT-3'，下游引物:5'-GT CAGGCAGCTCGTAGCTCTT-3';擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為106 bp。擴(kuò)增后通過(guò)凝膠成像，經(jīng)全自動(dòng)凝膠成像分析儀掃描DNA條帶灰度值，軟件分析條帶灰度比值，以β-actin的mRNA為參照，計(jì)算TLR3 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)TLR3表達(dá):將采集到的PBMC用PBS洗滌1次后，調(diào)細(xì)胞濃度至106個(gè)/mL，取500 μL，加入破膜劑孵育20 min后，再加入 FITCTLR3單抗在4℃下避光繼續(xù)孵育20 min，PBS洗滌1次，重懸細(xì)胞，0.5%多聚甲醛固定后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.6 免疫印跡檢測(cè)TLR3表達(dá):將剩余的PBMC用細(xì)胞裂解液裂解，BCA法測(cè)定裂解液總蛋白濃度，將裂解液蛋白樣品(50 μg總蛋白/泳道)經(jīng)10%SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜;分別加入抗TLR3及抗 β-actin抗體(一抗)在37℃孵育2 h，PBS-T洗膜4次;辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的兔抗小鼠IgG抗體(二抗)與膜孵育1 h，PBS-T洗膜4次，ECL試劑盒檢測(cè)印跡蛋白，X線片掃描后，用圖像分析軟件分析。

1.2.7 細(xì)胞因子檢測(cè):按照相關(guān)ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，每份血清設(shè)復(fù)孔，450 nm波長(zhǎng)下酶標(biāo)儀測(cè)定樣本的吸光度值(A)，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣本濃度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組PBMC中TLR3 mRNA的表達(dá)

復(fù)制不活躍組以及復(fù)制活躍組慢性乙肝患者PBMC的TLR3 mRNA表達(dá)水平均顯著低于健康對(duì)照組(P＜0.05);且HBV復(fù)制活躍組的TLR3 mRNA表達(dá)水平進(jìn)一步低于HBV復(fù)制不活躍組(P＜0.05)(圖1，表1)。

2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組PBMC中TLR3的表達(dá)

兩組慢性乙肝患者PBMC中TLR3+細(xì)胞百分?jǐn)?shù)均顯著低于健康對(duì)照組(P＜0.05);且HBV復(fù)制活躍組的TLR3+細(xì)胞百分?jǐn)?shù)進(jìn)一步低于HBV復(fù)制不活躍組(P＜0.05)(表2)。

圖1 RT-PCR檢測(cè)TLR3 mRNA的表達(dá)Fig 1 TLR3 mRNA expression detected by RT-PCR

2.3 免疫印跡檢測(cè)各組PBMC中TLR3的表達(dá)

慢性乙肝患者的TLR3表達(dá)水平低于健康對(duì)照組，且HBV復(fù)制活躍組的TLR2表達(dá)水平進(jìn)一步低于HBV復(fù)制不活躍組，這與流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果一致(圖2)。

2.4 ELISA檢測(cè)各組血清中相關(guān)細(xì)胞因子的水平

慢性乙肝患者血清中的TNF-α及IFN-β水平均顯著低于健康對(duì)照組(P＜0.05)，且HBV復(fù)制活躍組進(jìn)一步低于HBV復(fù)制不活躍組(P＜0.05)(表3)。

表1 PBMC中TLR3 mRNA表達(dá)Table 1 The TLR3 mRNA expression in PBMC

表2 PBMC中TLR3的表達(dá)Table 2 The TLR3 expression in PBMC

圖2 免疫印跡檢測(cè)PBMC中TLR3蛋白的表達(dá)Fig 2 The Western-blotting results of TLR3

表3 外周血TNF-α及IFN-β含量(ng/L)Table 3 Concentration of TNF-α and IFN-β in peripheral blood(ng/L)

3 討論

慢性乙型肝炎的致病機(jī)制一直是研究者關(guān)注的熱點(diǎn)，在乙型性肝炎病毒感染過(guò)程中，宿主的抗病毒免疫功能狀態(tài)將顯著影響疾病的發(fā)展，同時(shí)也是影響乙肝預(yù)后的一個(gè)重要的方面［10］。機(jī)體對(duì)病毒的有效識(shí)別和清除依賴于天然免疫和獲得性免疫的相互補(bǔ)充和協(xié)作，Toll樣受體家族(TLRs)是能夠識(shí)別病原體相關(guān)分子模式從而快速啟動(dòng)天然免疫反應(yīng)，并影響獲得性免疫反應(yīng)的發(fā)生和發(fā)展方向的關(guān)鍵性分子［11］。TLRs為Ι型跨膜信號(hào)蛋白受體在進(jìn)化上高度保守，不同的TLR有不同的細(xì)胞分布，而且可識(shí)別并區(qū)分不同類型的病原體。其中TLR3主要分布于體內(nèi)的單核細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞，在上述細(xì)胞的抗原提呈過(guò)程中發(fā)揮重要作用，TLR3可識(shí)別病毒在宿主體內(nèi)復(fù)制時(shí)產(chǎn)生的雙鏈RNA(dsRNA)，而且與乙肝病毒的感染和致病密切相關(guān)［12］。

本研究結(jié)果顯示，慢性乙肝患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中TLR3的mRNA以及蛋白表達(dá)水平均受到抑制，而且在病毒復(fù)制活躍的個(gè)體TLR3的抑制更為明顯;同時(shí)血清中與病毒免疫密切相關(guān)的細(xì)胞因子TNF-α和IFN-β的含量也表現(xiàn)出與TLR3相一致的趨勢(shì)，即在乙肝患者體內(nèi)水平下降，且降低幅度與病毒復(fù)制活性相關(guān)。這些結(jié)果強(qiáng)烈提示:TLR3的表達(dá)與慢性乙肝患者體內(nèi)的病毒復(fù)制直接相關(guān)，乙肝病毒感染可下調(diào)TLR3的表達(dá)，這很可能是乙肝病毒抑制宿主的抗病毒免疫，導(dǎo)致疾病發(fā)生的重要機(jī)制。

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