屈 嶺，顧 蓓，張 宏，石 玥，梁曉春*

(中國醫(yī)學科學院1.北京協(xié)和醫(yī)學院北京協(xié)和醫(yī)院中醫(yī)科，北京100730;2.基礎(chǔ)醫(yī)學研究所細胞中心，北京100005)

糖尿病周圍神經(jīng)病變(diabetic peripheral neuropathy，DPN)是糖尿病主要的慢性并發(fā)癥之一，其發(fā)病機制尚未完全闡明。自噬是機體處于物質(zhì)與能量代謝障礙時由細胞初級溶酶體處理內(nèi)容性底物的重要生理過程［1］。已有文獻報道其在保護胰島β細胞、改善胰島素抵抗以及延緩糖尿病慢性并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展等方面具有重要的作用［2］。有學者發(fā)現(xiàn)高濃度葡萄糖可減少INS-1β細胞的自噬［3］。前期研究曾經(jīng)證實高糖可下調(diào)體外原代培養(yǎng)雪旺細胞的增殖活性，并能上調(diào)活化的半胱氨酸天冬氨酸酶3(cysteine aspartase-3，caspase-3)的蛋白表達水平和轉(zhuǎn)錄水平［4－5］。自噬是否在高糖致體外培養(yǎng)雪旺細胞的損傷中也具有作用呢?為此本研究以永生化的大鼠雪旺細胞(RSC96)作為模型，觀察了高濃度葡萄糖對RSC96細胞自噬的影響以及自噬對高糖條件下RSC96細胞增殖活性及凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

RSC96細胞(一種永生化的大鼠雪旺細胞)，購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司)，胎牛血清(Fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、0.05%胰蛋白酶(Hyclone公司)，丙酮酸鈉、谷氨酰胺、G-418、MTT、3-MA(Sigma 公司)，兔抗大鼠Beclin1多克隆抗體(Abcam公司)，兔抗大鼠caspase-3多克隆抗體(Santa Cruz公司)，小鼠抗大鼠S-100單克隆抗體(博士德公司)，TRITC標記的山羊抗兔IgG、FITC標記的山羊抗小鼠IgG(北京西雅金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.2 RSC96細胞培養(yǎng)及培養(yǎng)條件

復(fù)蘇RSC96細胞，加入DMEM培養(yǎng)基、FBS(終濃度20%)、谷氨酰胺(終濃度2 mmol/L)、丙酮酸鈉(終濃度1 mmol/L)、HEPES(終濃度12.5 mmol/L)、PS(終濃度青霉素100 IU/mL、鏈霉素100 μg/mL)，2～3 d換液1次。正常對照(Con)組為DMEM培養(yǎng)基;高濃度葡萄糖(Glu)為DMEM培養(yǎng)基+葡萄糖(終濃度125 mmol/L)。自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine，3-MA)濃度10 mmol/L。

1.3 MTT比色法

取96孔板，棄培養(yǎng)基，加入10%MTT 200 μL/孔于37℃孵育2～4 h后，吸出培養(yǎng)液，加入 DMSO 200 μL/孔，室溫靜置30 min至1 h于酶標分析儀檢測吸光度值(absorbance，A)，檢測波長570 nm。重復(fù)5孔。

1.4 Western blot

各組細胞標本加入裂解液進行勻漿，離心取上清液，其蛋白濃度用BCA法測定，將含有50 μg蛋白的上清液用SDS-PAGE電泳分離，并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，用含5%脫脂奶粉的TBS-T中和硝酸纖維素膜降低非特異性結(jié)合。一抗孵育，沖洗后再用二抗孵育，采用ECL試劑盒檢測。條帶用Gel-Pro圖像分析系統(tǒng)掃描定量。重復(fù)3次。

1.5 免疫熒光檢測

制備細胞爬片，PBS沖洗后加入4℃丙酮固定15 min。0.1%Triton-X 100浸泡10 min打孔，加入正常血清封閉液，加入一抗工作液(1∶50稀釋)，陰性組對照組以PBS代替一抗，濕盒中4℃過夜，加入二抗工作液(1∶100稀釋)，37 ℃孵育20 min，加入 DAPI工作液，避光室溫下復(fù)染10 min。激發(fā)波長364 nm，發(fā)射波長488 nm，探測DAPI的藍色熒光;激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長525 nm，探測FITC綠色熒光和激發(fā)波長547 nm，發(fā)射波長620 nm，探測TRITC的紅色熒光。掃描速度:慢掃描。CLSM下觀察并用Leica Confocal圖像分析軟件照相。采用Image-Pro Plus 6.0軟件測量積分吸光密度(IA)。重復(fù)3次。

1.6 統(tǒng)計學分析

數(shù)據(jù)錄入和處理均采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件包，分析前采用One Sample Kolmoglrov-Smirnov Z test檢驗數(shù)據(jù)是否符合正態(tài)分布，符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差(±s)描述，2組樣本采用獨立樣本t檢驗，多組獨立樣本比較采用單因素方差分析，方差齊者采用 Bonferroni法，不齊者采用Tambane'sT2法;非正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用非參數(shù)檢驗方法(k個獨立樣本的檢驗)。

2 結(jié)果

2.1 高濃度葡萄糖下調(diào)體外培養(yǎng)雪旺細胞beclin1的表達

24 h Glu組beclin1蛋白表達較Con組顯著降低(P＜0.05)。其余各時間點兩組之間beclin1蛋白表達無差異(圖1A)。RSC96細胞中的beclin1蛋白被標記為紅色熒光，細胞質(zhì)被標記為綠色熒光，細胞核被標記為藍色熒光。Con組可見紅色熒光呈點片狀分布，主要集中在細胞核周圍區(qū)域內(nèi)。Glu組紅色熒光強度較Con組明顯減弱(圖1B)。半定量分析顯示(圖1C)，Glu組紅色熒光IA值較Con組明顯降低(P＜0.05)。

2.2 高濃度葡萄抑制體外培養(yǎng)雪旺細胞的增殖活性

6及24 h時各組A值無明顯差異，48 h時Glu組A值較Con組顯著減低(P＜0.05)，72 h時與Con組比較Glu組A值減低更加明顯(P＜0.01)(圖2)。

圖1 高濃度葡萄糖對體外培養(yǎng)RSC96細胞beclin1表達的影響Fig 1 The effect of the high concentration of glucose on beclin1 level of RSC96 cells in vitro

2.3 抑制自噬增加高濃度葡萄對外培養(yǎng)雪旺細胞增殖活性的削弱作用

與Con組比較，Glu組、Con+3-MA組及Glu+3-MA組A值均下降(P＜0.01)。與Glu組比較，Con+3-MA與Glu+3-MA組A值均下降(P＜0.01)。Con+3-MA與Glu+3-MA組間A值無明顯差異(圖3)。

2.4 抑制自噬增加caspase-3的活化

各組間caspase-3酶原的表達無明顯差異。與Con組比較，Glu及Con+3-MA組P20亞基表達無明顯增多。Glu+3-MA組P20亞基蛋白表達水平則較Con+3-MA組上調(diào)(P＜0.05);較Con組和Glu組明顯上調(diào)(P ＜0.01)(圖4A，B)。

3 討論

在生長因子缺乏等病理狀態(tài)下，細胞可形成雙層膜結(jié)構(gòu)包裹細胞器和細胞質(zhì)的自噬體，再與溶酶體融合形成自噬溶酶體，以降解其中的底物產(chǎn)生磷脂和蛋白質(zhì)等物質(zhì)［1］。借此機體不僅清除了受損的細胞器，而且產(chǎn)生的蛋白質(zhì)等又可作為原料重新參與代謝，為細胞提供能量，維持其存活。DPN患者神經(jīng)組織長期處于缺血缺氧、營養(yǎng)物質(zhì)和神經(jīng)因子缺乏的狀態(tài)以及持續(xù)存在的氧化應(yīng)激損傷是自噬現(xiàn)象出現(xiàn)異常的前提和基礎(chǔ)。然而，目前有關(guān)自噬與DPN關(guān)系的研究較少。僅有文獻報道在STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠脊髓背根神經(jīng)元中自噬現(xiàn)象明顯增多，經(jīng)DPN患者血清體外培養(yǎng)的SH-SY5Y細胞也可見自噬現(xiàn)象，自噬可能在細胞凋亡過程中起到保護作用［6－7］。

本實驗發(fā)現(xiàn)Glu組beclin1蛋白的表達水平較Con組明顯減少。beclin1是目前常用的自噬檢測指標之一，其參與自噬體形成的啟動過程，表達與自噬的發(fā)生正相關(guān)［8］。綜合免疫組織化學和 Western bolt的檢測結(jié)果，本研究初步認為高濃度葡萄糖將減少雪旺細胞中的自噬發(fā)生。

自噬在糖尿病慢性并發(fā)癥時具有何種病理生理作用目前尚不清楚，多數(shù)學者認為自噬可能具有延緩慢性并發(fā)癥進展的作用［2］。與既往研究結(jié)果一致［4］，本研究也證實高濃度葡萄糖能抑制體外培養(yǎng)的雪旺細胞的增殖活性，并且發(fā)現(xiàn)應(yīng)用3-MA抑制自噬后，加劇了高糖對雪旺細胞增殖活性的抑制作用。本實驗室既往曾觀察到高濃度葡萄糖能夠上調(diào)體外培養(yǎng)雪旺細胞中caspase-3表達［5］。那么自噬加劇高濃度葡萄糖對雪旺細胞增殖的抑制作用是否同通過調(diào)節(jié)凋亡途徑的而實現(xiàn)呢?此次研究發(fā)現(xiàn)自噬被抑制后，caspase-3的活化亦隨之上調(diào)。故推測自噬活性降低可能是高濃度葡萄糖增加細胞凋亡的機制之一。

綜上所述，根據(jù)本實驗的研究結(jié)果，推測高濃度葡萄糖通過下調(diào)自噬活性增加細胞凋亡，而造成細胞的損傷。這可能是DPN發(fā)生發(fā)展的機制之一。自噬可能是機體抵抗來自內(nèi)外損傷因素的一種重要途徑。糖尿病時可能抑制了正常的自噬活性，從而削弱了機體的自我修復(fù)能力，因此造成了包括DPN在內(nèi)的各種并發(fā)癥的發(fā)生。然而，本研究尚未完全揭示高糖條件下自噬下調(diào)的分子機制。今后應(yīng)進一步闡明高糖減少自噬的信號傳導(dǎo)途徑以及探討自噬對細胞凋亡影響的具體作用靶點。盡管如此，通過自噬防御途徑使機體減輕高糖、氧化應(yīng)激損傷等帶來損害，從而減少慢性并發(fā)癥的發(fā)生和進展，可能會為DPN的預(yù)防和治療提供嶄新的思路。

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