鄧德耀，袁文麗*，楊雙娟，馮 倩，高宗鷹，方 芳，李顯麗

(1.云南省第二人民醫(yī)院檢驗科，云南昆明650021;2.中國科學(xué)院昆明動物研究所遺傳資源與進(jìn)化國家重點實驗室，云南昆明650223;3.云南省第二人民醫(yī)院內(nèi)分泌科，云南昆明650021)

胰島特異性轉(zhuǎn)錄因子-配對盒4(paired box4，Pax4)基因?qū)儆诰幋a促進(jìn)胚胎組織細(xì)胞增殖、分化及存活的轉(zhuǎn)錄因子家族。Pax4基因表達(dá)對于維持胰島細(xì)胞表型及胰島β細(xì)胞的增殖和分化具有至關(guān)重要的作用［1－2］，它的基因多態(tài)性可能與糖尿病的發(fā)生相關(guān)［3－9］。本研究應(yīng)用高分辨率熔解曲線(high resolution melting，HRM)方法，對云南省昆明地區(qū)430例2型糖尿患者群Pax4基因Arg121Trg多態(tài)性(rs114202595)進(jìn)行分析，旨在探討Pax4基因Arg121Trg多態(tài)性與2型糖尿患者群的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 研究對象

本研究選擇了云南省昆明地區(qū)具有醫(yī)療記錄的430例2型糖尿病患者(T2DM)、200例糖耐量減低人群(IGT)和446例性別和年齡相匹配的OGTT正常的體檢人群(NGT)，并獲得了受試者的知情同意。糖尿病及糖耐量減低診斷采用WHO1999年診斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 試劑

即用PCR擴(kuò)增試劑盒(上海生工生物工程有限公司)，LightCycler 480高分辨率熔解擴(kuò)增試劑盒(德國羅氏診斷有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 臨床資料收集:所有研究對象采用統(tǒng)一調(diào)查表進(jìn)行調(diào)查，內(nèi)容包括一般情況、個人史、家族史以及藥物使用情況等。研究對象行OGTT試驗后在日立7600全自動生化分析儀上測定血糖。胰島素和C肽均用放射免疫法檢測。穩(wěn)態(tài)模型胰島素抵抗指數(shù)HOMA-IR=FPG×FINS/22.5，穩(wěn)態(tài)模型胰島素分泌指數(shù)HOMA-β=20×FINS/(FPG－3.5)。

1.3.2 基因組DNA制備:酚-氯仿-異戊醇法提取基因組DNA，紫外分光光度計對DNA濃度進(jìn)行測定，將所有DNA樣品稀釋至20 ng/μL。

1.3.3 引物的合成:根據(jù)Primer 3.0軟件設(shè)計Pax4基因的引物。上游引物序列:5'-GTAGGTGGAGAC AGATGGGAAA-3';下游引物序列:5'-GTAGTCCCTG GTCCTCCTGTAA-3'。引物由上海生工生物工程有限公司合成，用HPLC純化。

1.3.4 HRM檢測:Pax4基因 Arg121Trg多態(tài)性PCR體系:10 ng的基因組DNA、1×PCR Master mix、2.0 mmol/L MgCl2、200 nmoL的正反向引物，并用PCR級別的水補(bǔ)足至20 μL。PCR條件:95℃預(yù)變性10 min后行觸底PCR，即95℃ 10 s，65℃ ～55℃退火15 s，72℃ 10 s，55個循環(huán)，其中前10個循環(huán)65℃ ～55℃，每個循環(huán)退火溫度降1度，后45個循環(huán)退火溫度維持55℃。HRM分析條件:95℃1 min，40℃ 1 min，熔解曲線數(shù)據(jù)收集從65℃到95℃，溫度上升率為1℃/s，且每升高1℃進(jìn)行15次數(shù)據(jù)采集。最后40℃冷卻10 s。應(yīng)用gene scanning軟件進(jìn)行實時數(shù)據(jù)檢測和分析。隨機(jī)選取不同熔解曲線的產(chǎn)物共20例測序驗證基因型結(jié)果。以測序得到的野生純合子GG(Arg/Arg)、突變雜合子GA(Arg/Trg)和突變純合子AA(Trg/Trg)分別作為標(biāo)準(zhǔn)品，分析其他DNA樣本基因型。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

3組間年齡、性別構(gòu)成比無差異。與NGT組相比，IGT及 T2DM組的 FBG、PBG均有升高 (P＜0.01)。IGT和T2DM組的FINS和C0min均顯著高于NGT組(P＜0.05);IGT組PINS和C120min均顯著高于NGT組(P＜0.01)和T2DM組(P＜0.05)。IGT、T2DM組的HOMA-IR均顯著高于NGT組(P＜0.01)，而T2DM組的HOMA-β則顯著低于NGT組(P＜0.01)和IGT組(P＜0.05);從 NGT到 IGT到T2DM過程中，HOMA-IR逐漸增加(表1)。

Pax4基因Arg121Trg單核苷酸多態(tài)性位點基因型(圖1)明顯的分為 GG(Arg/Arg，藍(lán)色曲線)、GA(Arg/Trg，紅色曲線)、AA(Trg/Trg綠色曲線)3型，且與測序結(jié)果一致(圖2)。

GG純合子(Arg/Arg)在T2DM組中的頻率0.909，在IGR組中為0.935，在NGT組為0.939;A等位基因(Trp121)和G等位基因(Arg121)的頻率在3組間分布如表2所示。T2DM組Arg121Trg單核苷酸多態(tài)性GA+AA基因型(Arg/Trg+Trg/Trg)人群的胰島素使用率為69.2%，顯著高于GG基因型(Arg/Arg)人群(P=0.001)。而GG基因型和GA+AA基因型的表型間的其他指標(biāo) FBG、FINS、C0min、PBG、PINS、C120min、HOMA-IR和HOMA-β見表3所示。

表1 NGT、IGT和T2DM組個體臨床變量比較Table 1 The clinical data in normal group，glucose tolerance group and diabetes group

圖1 Pax4基因Arg121Trg多態(tài)性3種不同基因型的高分辨率熔接曲線圖Fig 1 Genotyping of Arg121Trg polymorphism of Pax4 by high resolution melting

圖2 Pax4基因Arg121Trg多態(tài)性3種不同基因型的測序圖Fig 2 Genotyping of Arg121Trg polymorphism of Pax4 by sequencing

表2 T2DM組、IGT組和NGT組Pax4基因Arg121Trg基因型與等位基因分布頻率Table 2 The distribution frequencies of genotype and allele of Arg121Trg among type 2 diabetes group，impaired glucose tolerance group and normal group

表3 T2DM組Pax4基因Arg121Trg基因多態(tài)性與臨床變量Table 3 The polymorphism of Arg121Trg of Pax4 gene and clinical data in type 2 diabetes group

3 討論

在本研究中，云南省昆明地區(qū)430位T2DM患者Pax4基因rs114202595位點GG基因型及A等位基因頻率與日本人［7］、印度北部［8］及中國湖南省人群［9］的文獻(xiàn)報道不盡一致，且3組間未見顯著性差異。這些不同國家和地區(qū)Trg121分布頻率的差異很可能源于遺傳異質(zhì)性、群體差異或者是基因和環(huán)境的相互作用。本研究中T2DM組患者FBG平均水平在8.015左右，但FINS和C0min水平較IGT組未見明顯升高，同時PINS和C120min均顯著低于IGT組。說明本研究中T2DM人群存在一定程度的胰島β細(xì)胞分泌功能的早期損害。值得注意的是，本研究中T2DM組GA+AA基因型人群的胰島素使用率比GG基因型顯著增加，此結(jié)果與日本793例2型糖尿病患者不同基因型研究中胰島素使用情況一致［7］。結(jié)合起來分析，Pax4基因 Arg121Trg位點 A等位基因可能是2型糖尿患者群胰島β功能進(jìn)展性紊亂的一個分子標(biāo)記。也就是說，含有A等位基因的T2DM人群存在嚴(yán)重的胰島素缺乏，他們需要更早接受胰島素治療來代替口服降糖藥物治療。當(dāng)然，本研究樣本量較小，尚需進(jìn)一步的大樣本量前瞻性研究加以證明。

本研究還發(fā)現(xiàn)T2DM組Pax4基因Arg121Trg多態(tài)性兩種基因型間的臨床變量除胰島素使用率外，其他指標(biāo)均無明顯差異，而在日本人的研究中觀察到Trp121攜帶者第一相C-肽分泌水平顯著高于對照人群［7］，以湖南省人群為受試對象的研究發(fā)現(xiàn)R等位基因攜帶者餐后胰島素水平顯著高于W等位基因攜帶者［9］，但在本研究中并未觀察到上述差異。此結(jié)果提示，除Pax4基因Arg121Trg多態(tài)性外，還可能存在其他的未證實因素共同影響胰島β細(xì)胞的分泌功能。Pax4基因Arg121Trg多態(tài)性A等位基因(Trp121)，作為2型糖尿患者群胰島β功能進(jìn)展性紊亂的分子標(biāo)記之一，也許并未對其可能出現(xiàn)的胰島素分泌能力紊亂做出重要的貢獻(xiàn)，而僅是其發(fā)生的因素之一。

本研究只是在應(yīng)用HRM方法的基礎(chǔ)上對較小樣本T2DM人群Pax4基因Arg121Trg位點進(jìn)行了多態(tài)性分析，并推測A等位基因(Trp121)可能是2型糖尿患者群胰島β功能進(jìn)展性紊亂的一個分子標(biāo)記，含有A等位基因(Trp121)的2型糖尿患者群需要更早接受胰島素治療來代替口服降糖藥物治療。當(dāng)然，精確的評估尚需通過大規(guī)模臨床試驗和流行病學(xué)研究予以證實。

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