左芳雷 馮秀娟 陳尚武

腫瘤可以從原發(fā)灶處轉(zhuǎn)移至遠(yuǎn)端器官，這是大部分惡性腫瘤都具有的一大特征，也是導(dǎo)致大多數(shù)癌癥患者死亡的重要原因。腫瘤轉(zhuǎn)移抑制蛋白能夠在腫瘤轉(zhuǎn)移的多個(gè)步驟中發(fā)揮調(diào)控作用，在體內(nèi)阻止或抑制腫瘤轉(zhuǎn)移過程，是近幾年腫瘤領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。到目前為止，已經(jīng)明確具有抑制腫瘤轉(zhuǎn)移功能的基因包括KISS-1基因、KAI1基因、NM23-H1基因等［1，2］。NM23-H1是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)，也是被研究得最充分的一個(gè)腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因。它具有的組氨酸激酶活性，核苷二磷酸激酶活性和3'-5'核酸外切酶活性是其發(fā)揮腫瘤轉(zhuǎn)移抑制功能的重要因素［3，4］。KISS-1是新近發(fā)現(xiàn)的一個(gè)腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因，其編碼的Kisspeptin是一類肽類激素，是G蛋白偶聯(lián)受體GPR45的內(nèi)源性配體，在抑制腫瘤轉(zhuǎn)移上扮演重要角色［5-7］。以基因表達(dá)和直接施用腫瘤轉(zhuǎn)移抑制蛋白來治療腫瘤是具有廣闊發(fā)展前景的策略，實(shí)際上，國(guó)外已經(jīng)展開了KISS-1 蛋白的臨床前檢測(cè)研究［1］。

本研究對(duì)人源KISS-1 和NM23-H1 基因進(jìn)行了克隆和大腸桿菌表達(dá)，并得到了純化重組蛋白，旨在為將來的臨床應(yīng)用積累堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞組織、質(zhì)粒和菌株 人乳腺癌細(xì)胞、胎盤組織由實(shí)驗(yàn)室保藏；pMD19-T simple載體（TaKaRa，大連），大腸桿菌表達(dá)載體 pET-30a（+）（Invitrogen，上海）；大腸桿菌E.coli DH5α，BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞（全式金，北京）。

1.1.2 工具酶及其他試劑 限制性內(nèi)切酶，T4 DNA Ligase，Ex Taq DNA聚合酶，DL2000、DL15000 DNA marker等（TaKaRa，大連）；Trizol 試劑（Invitrogen，上海）；M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Promega，北京）；X-Gal、IPTG、抗生素等藥品均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)生物試劑；引物合成及序列測(cè)定由博邁德（Biomed，北京）生物技術(shù)有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取及反轉(zhuǎn)錄cDNA制備 取人乳腺癌細(xì)胞或胎盤組織放入液氮速凍，用研缽研成粉末，加入1mL Trizol振蕩混勻，室溫放置5min；加入200μL預(yù)冷的三氯甲烷，混勻，室溫放置5min；4℃12000r/min離心10min；取上清，加入等體積預(yù)冷異丙醇，-20℃沉淀1h；4℃ 12000r/min 離心10min，沉淀以70％預(yù)冷乙醇洗滌一次；沉淀自然晾干后以20μL DEPC處理水溶解。

參照試劑盒說明書，合成第一鏈cDNA，步驟為：將 2-5 μL 總 RNA 和 1 μL Oligo（dT）primer 混合，65℃水浴5min；低速離心30s，將液體甩入管底，加入 5 μL 5×buffer和 1 μL反轉(zhuǎn)錄酶，混勻；42℃水浴1h；95℃處理5min，冰浴冷卻，-20℃保藏備用。1.2.2 KISS-1和NM23-H1的克隆 以胎盤組織cDNA為模板，以引物hKISS-1-F1和hKISS-1-R1擴(kuò)增KISS1基因，上下游引物分別引入NdeⅠ和XhoⅠ限制性酶切位點(diǎn)，下游引物5'端棄去終止密碼子，使其可以和載體pET-30a（+）C端His-Tag序列相連（表1）；同樣，以乳腺癌細(xì)胞cDNA為模板，以引物NM23-H1-F1和NM23-H1-R1擴(kuò)增NM23-H1基因，上下游引物也分別引入NdeⅠ和XhoⅠ限制性酶切位點(diǎn)，下游引物5'端也棄去終止密碼子（表1）。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 1min，循環(huán) 30次；72℃延伸 10min。將PCR 產(chǎn)物連接到克隆載體pMD19-T simple上，轉(zhuǎn)化E.coli DH5α，篩選陽性克隆提取質(zhì)粒pMD19-KISS-1和pMD19-NM23-H1，并進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果和NCBI上發(fā)布的序列進(jìn)行Blast比對(duì)分析。

1.2.3 KISS-1和NM23-H1表達(dá)載體的構(gòu)建和重組菌株構(gòu)建 以NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切質(zhì)粒pMD19-KISS-1，pMD19-NM23-H1和 載 體 pET-30a（+）回收目標(biāo)片段，以T4 DNA Ligase連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli DH5α。提取陽性克隆質(zhì)粒并測(cè)序確定目標(biāo)基因的正確連入，得到表達(dá)載體pET30a（+）-KISS-1和 pET30a（+）-NM23-H1。將 pET-30a（+）、pET30a（+）-KISS-1 和 pET30a（+）-NM23-H1分別轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主E.coli BL21（DE3），得到KISS-1和NM23-H1的大腸桿菌重組菌株。

表1 基因克隆和載體構(gòu)建所用到的引物

1.2.4 KISS-1的融合表達(dá)載體構(gòu)建重組菌株構(gòu)建 以pMD19-KISS-1為模板，以引物hKISS-1-F2和hKISS-1-R2擴(kuò)增KISS-1，上下游引物分別引入NcoⅠ和XhoⅠ限制性酶切位點(diǎn)（表1），PCR產(chǎn)物的TA克隆過程同1.2.2，得到pMD19-KISS-1-fusion。pMD19-KISS-1-fusion以 NcoⅠ和XhoⅠ雙酶切連入pET-30a（+）得到融合表達(dá)載體 pET30a（+）-KISS-1-fusion，KISS-1N端和載體上的一段已有氨基酸序列相連并含有His-Tag標(biāo)簽。另外，以pMD19-NM23-H1為模板，以引物NM23-H1-F1和NM23-H1-R2擴(kuò)增NM23-H1，上下游引物分別引入NdeⅠ和KpnⅠ限制性酶切位點(diǎn)（表1），PCR產(chǎn)物的TA克隆過程同1.2.2，得到pMD19-NM23-H1-fusion。將pMD19-NM23-H1-fusion以 NdeⅠ和KpnⅠ雙酶切連入到以相同酶切位點(diǎn)酶切的pET30a（+）-KISS-1-fusion中，替換了載體上已有的氨基酸序列和His-Tag標(biāo)簽，將KISS-1融合在NM23-H1C端，得到融合表達(dá)載體pET30a（+）-NK-fusion。pET30a（+）-KISS-1-fusion和pET30a（+）-NK-fusion的重組菌株構(gòu)建方法同

1.2.3。

1.2.5 KISS-1和NM23-H1誘導(dǎo)表達(dá) pET-30a（+）、pET30a（+）-KISS-1和 pET30a（+）-NM23-H1的重組菌株單菌落過夜培養(yǎng)，按0.5％接種于10mL新鮮的LB 培養(yǎng)基中，37℃ 250r/min培養(yǎng)3h 至OD600為0.4-0.6左右，將菌液等分為兩份，一份加入終濃度為0.5mmol/L的IPTG，另一份做對(duì)照，于28℃ 250r/min誘導(dǎo)表達(dá)3h。離心收集菌體，以預(yù)冷的PBS緩沖液洗滌兩次，溶解于1mL PBS，以320W功率超聲波破碎細(xì)胞，超聲開3s，停5s。采用15％的SDS-PAGE凝膠電泳分析蛋白表達(dá)情況。

1.2.6 重組蛋白的純化 利用pET-30a（+）載體上的His-Tag，采用親和層析方法純化KISS-1和NM23-H1重組蛋白。KISS-1和NM23-H1重組菌株過夜培養(yǎng)，按0.5％接種于400mL新鮮的LB 培養(yǎng)基中，37℃ 250r/min培養(yǎng)3h 至OD600為0.4-0.6左右，加入終濃度為0.5mmol/L的IPTG，于28℃ 250r/min誘導(dǎo)表達(dá)過夜（約8-10h）。4℃ 6000r/min離心收集菌體，以預(yù)冷的PBS緩沖液洗滌兩次，溶解于10mL PBS，加入1mmol/L的蛋白酶抑制劑PMSF和0.5mg/mL的溶菌酶，冰浴30min。以320 W率超聲波破碎細(xì)胞，超聲開3s，停5s。可溶性蛋白純化直接將超聲波破碎上清液進(jìn)樣到含有Ni-NTA填料的親和層析柱中，收集以不同濃度咪唑梯度洗脫的蛋白。采用15％的SDS-PAGE凝膠電泳分析回收蛋白。

2 結(jié)果

2.1 RNA提取及反轉(zhuǎn)錄

采用Trizol抽提人乳腺癌細(xì)胞和胎盤組織總RNA，結(jié)果（圖1）顯示，RNA提取效果較好，可以進(jìn)一步做反轉(zhuǎn)錄。以O(shè)ligo（dT）primer為引物做反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA文庫，如圖2所示，cDNA呈均勻的彌散狀態(tài)，可以用作PCR克隆的模板。

2.2 KISS1和NM23-H1的克隆

以人乳腺癌細(xì)胞和胎盤組織cDNA為模板，設(shè)計(jì)引物（表1）擴(kuò)增NM23-H1和KISS-1基因。結(jié)果（圖3）顯示，以乳腺癌細(xì)胞cDNA為模板擴(kuò)增得到了目標(biāo)大小的NM23-H1基因（467bp），以胎盤組織cDNA為模板擴(kuò)增得到了目標(biāo)大小的KISS-1基因（423bp）。

圖1 人乳腺癌細(xì)胞和胎盤組織總RNA

圖2 人乳腺癌細(xì)胞和胎盤組織cDNA

圖3 NM23-H1（A）和KISS-1（B）的PCR產(chǎn)物電泳

PCR產(chǎn)物經(jīng)切膠回收，連接T載體pMD19-T simple，陽性克隆進(jìn)行測(cè)序分析。測(cè)序結(jié)果和NCBI上發(fā)布的序列進(jìn)行Blast比對(duì)分析，結(jié)果顯示與GenBank上公布的KISS-1和NM23-H1基因序列同源性達(dá)100％，可以進(jìn)一步做表達(dá)研究。

2.3 表達(dá)載體的構(gòu)建與轉(zhuǎn)化

將KISS-1和NM23-H1分別連接到大腸桿菌表達(dá)載體pET-30a（+）上，N端融合His-Tag標(biāo)簽，以便于純化重組蛋白。在分析了重組KISS-1和NM23-H1的表達(dá)情況后，又構(gòu)建了KISS-1和NM23-H1的融合表達(dá)載體，即將KISS-1N端和載體上的已有氨基酸序列相連并含有His-Tag標(biāo)簽，另外將NM23-H1替換載體序列連接在KISS-1N端，這樣可以增加KISS-1的表達(dá)效率。載體的具體構(gòu)建結(jié)構(gòu)，見圖4。明顯的表達(dá)條帶。

圖4 KISS-1和NM23-H1的表達(dá)載體構(gòu)建結(jié)構(gòu)圖

圖5 KISS-1和NM23-H1表達(dá)的SDS-PAGE分析

2.4 重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)

pET30a（+）-KISS-1和 pET30a（+）-NM23-H1重組菌株經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，SDS-PAGE電泳（圖5）分析顯示，NM23-H1得到很好的表達(dá)，在20kD處有一條高豐度表達(dá)蛋白（箭頭所示），表達(dá)量占總表達(dá)量的50％以上，表觀分子量略高于理論值（理論值18.2kD）。而KISS-1沒有明顯差異蛋白條帶。

分析 pET30a（+）-KISS-1-fusion 和 pET30a（+）-NK-fusion重組菌株融合表達(dá)KISS-1蛋白情況，結(jié)果表明在細(xì)胞破碎上清中，KISS-1-fusion有極少量的可溶性表達(dá)蛋白，而NK-fusion幾乎沒有可溶性表達(dá)（數(shù)據(jù)未附）。包涵體SDS-PAGE電泳結(jié)果（圖6）表明，KISS-1-fusion 即 KISS-1和載體融合的基因得到了大量表達(dá)，但是大部分為沒有活性的不可溶包涵體蛋白，占總包涵體量的70％以上，其表觀分子量為24kD左右，比理論值高5kD（理論值19.6kD）。然而，KISS-1與NM23-H1融合基因沒有得到

圖6 KISS-1-fusion 和 NK-fusion表達(dá)的SDS-PAGE分析

2.5 重組蛋白的純化

對(duì)pET30a（+）-KISS-1-fusion重組菌株表達(dá)的KISS-1-fusion包涵體蛋白和pET30a（+）-NM23-H1重組菌株表達(dá)的NM23-H1蛋白進(jìn)行親和層析純化，以SDS-PAGE電泳分析純化效果，結(jié)果如圖7所示。由圖7-A可見，在含有6mol/L脲和300mmol/L咪唑溶液洗脫下，KISS-1-fusion蛋白被洗脫下來，在目標(biāo)蛋白上方有兩條蛋白帶，分子量為50kD左右的蛋白帶是非特異性蛋白殘留，而分子量為35kD大小的蛋白帶，推測(cè)為KISS-1-fusion發(fā)生聚合而得。由圖7-B可見，NM23-H1在含300mmol/L咪唑溶液洗脫下得到分離，但是具有兩條蛋白帶，分子量分別為18kD和15kD左右，推測(cè)15kD蛋白帶是由18kD蛋白帶發(fā)生部分降解所致。進(jìn)一步研究需要通過質(zhì)譜鑒定來確定純化后蛋白產(chǎn)生的不同結(jié)構(gòu)。

圖7 KISS-1-fusion包涵體重組蛋白（A）和NM23-H1重組蛋白（B）的純化

3 討論

研究表明，腫瘤細(xì)胞在癌癥發(fā)展的早期其實(shí)就已經(jīng)開始從原發(fā)灶脫離并轉(zhuǎn)移到別處了，腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因編碼的蛋白能夠在體內(nèi)阻止或抑制腫瘤轉(zhuǎn)移過程。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了20多種腫瘤抑制基因，其中包括能調(diào)控腫瘤細(xì)胞代謝信號(hào)通路的基因以及能夠調(diào)控腫瘤細(xì)胞黏附、遷移、死亡以及血管生成過程的基因［1］。KISS-1是目前研究較多的腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因，其編碼蛋白具有抑制腫瘤轉(zhuǎn)移，調(diào)節(jié)生殖功能以及影響內(nèi)分泌等作用［7］；NM223-H1是研究較為清晰的腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因，其編碼蛋白具有影響信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)的運(yùn)作，參與微管聚合運(yùn)動(dòng)，影響細(xì)胞黏合和細(xì)胞有絲分裂等［8］。

國(guó)內(nèi)學(xué)者早期做過NM223-H1的原核表達(dá)［8，9］，得到含有生物活性的KISS-1蛋白，然而，國(guó)內(nèi)研究者還沒有關(guān)于KISS-1的表達(dá)研究。本研究在構(gòu)建KISS-1重組菌株時(shí)發(fā)現(xiàn)，沒有融合其他序列的KISS-1轉(zhuǎn)化宿主菌后會(huì)導(dǎo)致宿主死亡，幾乎得不到陽性克隆，轉(zhuǎn)化毒性蛋白表達(dá)宿主BL21（DE3）plysS 也得不到陽性克隆，推測(cè)KISS-1的本底表達(dá)可能對(duì)宿主的正常生長(zhǎng)和代謝造成影響。將KISS-1與載體序列連接后，KISS-1得到了成功表達(dá)，雖然大部分表達(dá)產(chǎn)物為包涵體形式。進(jìn)一步的研究需要鑒定分析純化蛋白的結(jié)構(gòu)組成，并對(duì)其生物學(xué)活性進(jìn)行分析，評(píng)價(jià)其作為生物藥物分子的性能。

另外，利用乳酸菌呈遞預(yù)防和治療藥物分子實(shí)施疾病治療是近幾年研究的熱點(diǎn)［10-12］，有些研究已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段［13］。本研究所在實(shí)驗(yàn)室也對(duì)KISS-1進(jìn)行了以乳酸菌為宿主的分泌型表達(dá)，通過NICE系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了經(jīng)過依據(jù)乳酸菌密碼子偏好性修飾的KISS-1的表達(dá)（未發(fā)表數(shù)據(jù)）。這些基礎(chǔ)研究為將來重組腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因蛋白和重組菌株投入到臨床應(yīng)用打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究從人胎盤組織和乳腺癌細(xì)胞中克隆得到腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因KISS-1和NM23-H1，并導(dǎo)入到大腸桿菌BL21（DE3）中表達(dá)。研究證明，NM23-H1能夠在大腸桿菌中可溶性表達(dá)；而KISS-1需要與載體的部分序列融合才能夠得到有效表達(dá)，且表達(dá)產(chǎn)物為不可溶的包涵體蛋白。

［1］Smith SC, Theodorescu D. Learning therapeutic lessons from metastasis suppressor proteins ［J］. Nature Reviews, 2009, 9：253-264.

［2］Yoshida BA,Dubauskas Z,Sokoloff MM, et al. Metastasissuppressor genes：a review and perspective on an emerging field ［J］.Journal of the National Cancer Institute, 2000, 92（21）：1717-1730.

［3］葉蘇娟, 朱文.nm23-H1調(diào)控腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移分子機(jī)制研究進(jìn)展［J］. 生命科學(xué) , 2009, 21（1）：107-111.

［4］Zhang QB, McCorkle JR, Novak M. Metastasis suppressor function of NM23-H1requires its 3'-5' exonuclease activity ［J］. International Journal of Cancer, 2011, 128（1）：40-50.

［5］Kotani M, Detheux M, Vandenbogaerde A. The metastasis suppressor gene KiSS-1encodes kisspeptins, the natural ligands of the orphan G protein-coupled receptor GPR54［J］. The Journal of Biological Chemistry, 2001, 276（37）：34631-34636.

［6］Ohtaki T, Shintani Y, Honda S. Metastasis suppressor gene KiSS-1encodes peptide ligand of a G-protein-coupled receptor ［J］. Nature,2001, 411：613-617.

［7］Popa SM, Clifton DK, Steiner RA. The role of kisspeptins and GPR54in the neuroendocrine regulation of reproduction ［J］. Annual Review of Physiology, 2008, 70：213-238.

［8］侯宇, 趙麗淦, 張美英, 等. Nm23-H1/ NDPK-A 基因在大腸桿菌中的高效表達(dá)及產(chǎn)物純化的研究［J］.中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué), 1998, 14（6）：655-660.

［9］孫艷梅, 趙利淦, 張美英, 等.重組人融合基因Nm23-H1/HbFGF的構(gòu)建及其在大腸桿菌中表達(dá)的研究［J］. 生物工程學(xué)報(bào) , 2000, 16（5）：551-556.

［10］Wells JM, Mercenier A. Mucosal delivery of therapeutic and prophylactic molecules using lactic acid bacteria ［J］. Nature Reviews, 2008, 6：349-362.

［11］Steidler L, Hans W, Schotte L, et al. Treatment of murine colitis by Lactococcus lactis secreting interleukin-10［J］. Sciene, 2000, 289（5483）：1352-1355.

［12］Yao J, Wang JY, Lai MG, et al. Treatment of mice with dextran sulfate sodium-induced colitis with human interleukin 10secreted by transformed Bifidobacterium longum ［J］. Molecular Pharmaceutics, 2011, 8（2）：488-497.

［13］Braat H, Rottiers P, Homomes DW, et al. A phase I trial with rransgenic bacteria expressing interleukin-10 in crohns disease ［J］.Clinical Gastroenterology and Hepatology, 2006, 4（6）：754-759.