李俊霞 張日俊 陳東東

（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，北京 100193）

大多數(shù)植物細(xì)胞壁含有約15%-40%的纖維素、30%-40%的半纖維素、幾丁質(zhì)和20%的木質(zhì)素［1]。這些組分難以被畜禽降解，但是可以被某些微生物產(chǎn)生的相應(yīng)的酶系所降解。借助于這些酶的作用，植物細(xì)胞中的淀粉、蛋白質(zhì)和脂肪等營養(yǎng)物質(zhì)得以釋放，從而提高植物飼料的消化利用率。微生物產(chǎn)生的能降解植物細(xì)胞壁的酶系分為兩類，第一類為好氧真菌和細(xì)菌產(chǎn)生的游離纖維素酶系、半纖維素酶系和一些輔酶；第二類為某些厭氧微生物產(chǎn)生的大分子量胞外多酶復(fù)合體（分子量650 kD-2.5 MD）［2]，稱為纖維體（cellulosome）。

纖維體的基本組件是非催化活性的腳手架蛋白（scaffoldin）和多個具有催化活性的糖基水解酶亞單位。腳手架蛋白上含有多個黏附域（cohesin modules），每個酶亞單位上也都含有塢因子（dockerin domain），酶亞單位通過各自的塢因子和腳手架蛋白上相應(yīng)的黏附域特異性相結(jié)合，充分發(fā)揮各酶之間的協(xié)同作用，高效降解植物細(xì)胞壁。因此，纖維體是一個完美組合的實體，而非各個組分的簡單聚集，其降解細(xì)胞壁的效率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于幾個游離酶的協(xié)同。纖維體高效降解細(xì)胞壁的特性引起了廣大研究者的興趣。

目前僅在一些厭氧細(xì)菌中得到了纖維體，尤其是梭菌和瘤胃微生物，如Bacteroides cellulosolvens（溶纖維擬桿菌）［3]，Clostridium cellulovorans（嗜纖維梭菌）［4]，C. thermocellum（熱梭菌）［5]，C.cellulolyticum（解纖維梭菌）［6]，C. josui（約氏梭菌）［7]，C. papyrosolvens（溶紙莎草梭菌）［8]，Ruminococcus flavefaciens（生黃瘤胃球菌）［9]，R. albus（白色瘤胃球菌）［10]。最近，有報道稱在厭氧真菌Piromyces equi中也發(fā)現(xiàn)了纖維體，但是并未發(fā)現(xiàn)編碼腳手架蛋白基因的存在。在產(chǎn)生纖維體的細(xì)菌中，C.cellulovorans分離自木漿粗纖維紙，是一種產(chǎn)孢、嗜中溫的革蘭氏陽性菌，它產(chǎn)生大量的纖維素酶，能降解晶型纖維素［11]。本研究就針對C.cellulovorans纖維體的結(jié)構(gòu)、功能、基因簇和基因工程方面的研究進展進行綜述，以期為其他纖維體的研究提供思路及構(gòu)建特殊功能的mini-cellulosome、纖維體在生物技術(shù)上的應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

1 Clostridium cellulovorans纖維體的組成

嗜纖維梭菌纖維體依附在細(xì)胞表面，分子量大約為1×106Da，有至少10個亞單位組成。其中一個重要的亞單位是腳手架蛋白CbpA，并且只含有1個CbpA［12]，分子量為189 kD。腳手架蛋白不具有催化活性，但是含有多個功能域，模型見圖1。

1.1 腳手架蛋白的結(jié)構(gòu)和功能

嗜纖維梭菌纖維體的SDS-PAGE電泳分析結(jié)果顯示，纖維體存在多個亞單位，包括3個主要的條帶170 kD（P170），100 kD（P100）和70 kD（P70），其他的小條帶分子量范圍在35 kD-120 kD之間［11]。羧甲基纖維素酶活性分析顯示，只有P170蛋白沒有催化活性。P170蛋白具有多重功能，除了結(jié)合多酶亞單位外，還可以將纖維素的結(jié)晶型排列方式轉(zhuǎn)變成易于被酶亞單位降解的非晶型排列，使得整個纖維體能有效降解結(jié)晶型纖維素，而纖維體上單個游離酶只能降解可溶性和非結(jié)晶纖維素［11]。

通過反相PCR得到了編碼P170蛋白的全部基因序列，此基因被命名為cbpA，編碼的蛋白稱為腳手架蛋白CbpA，其分子量為189 kD［14]。cbpA基因的N端編碼信號肽，成熟蛋白的N端存在1個纖維素結(jié)合域CBD，4個表層同源結(jié)構(gòu)域SLH［15]，9個黏附域或稱酶結(jié)合域（也稱疏水區(qū)）［14]。CBD能結(jié)合不同形式的纖維素，但是相對于非晶型纖維素來說，此CBD更偏向于結(jié)合結(jié)晶型纖維素。CBD能結(jié)合和晶型纖維素結(jié)構(gòu)相似的幾丁質(zhì)。CBD對纖維體和降解基質(zhì)之間的結(jié)合發(fā)揮著重要作用。針對C.cellulovorans而言，纖維體上的4個表層同源結(jié)構(gòu)域也稱親水區(qū)。另外，在研究EngE的結(jié)構(gòu)域時發(fā)現(xiàn)3個重復(fù)的類-SLH域串聯(lián)位于內(nèi)切葡聚糖酶基因engE的N端，內(nèi)切葡聚糖酶通過此結(jié)構(gòu)域既和腳手架蛋白CbpA相連又結(jié)合在細(xì)菌表面。9個黏附域高度保守、同源，各個酶亞單位通過塢因子-黏附域特異結(jié)合在腳手架蛋白上。Park等［16]研究黏附域1、6與兩個酶亞單位P100、P70之間的親和性，結(jié)果顯示黏附域6比黏附域1更高效的結(jié)合這兩種酶亞單位，說明黏附域結(jié)合酶亞單位的能力不同。但是關(guān)于C. thermocellum和C. cellulolyticum纖維體的相關(guān)研究結(jié)果表明，不同黏附域和酶亞單位上塢因子的結(jié)合能力相同。另外一項相關(guān)研究是體外克隆C.cellulovorans的黏附域，結(jié)果發(fā)現(xiàn)克隆出的黏附域同樣可以與纖維體的酶亞單位相結(jié)合，說明了酶亞單位上的塢因子是黏附域和酶亞單位結(jié)合的關(guān)鍵性因素。根據(jù)這幾項研究結(jié)果推測，黏附域和酶亞單位的結(jié)合能力可能取決于酶亞單位上塢因子的某些特性。如塢因子的大小和空間結(jié)構(gòu)等，不同的產(chǎn)纖維體菌種，其塢因子的這類特性不同。關(guān)于黏附域的功能，Park和Doi還發(fā)現(xiàn)了黏附域不僅結(jié)合酶亞單位，而且不同的黏附域之間也能互相結(jié)合，這就使得不同CbpA之間通過黏附域聚集從而形成多聚纖維體。

纖維體上除CbpA非酶蛋白外，還存在另外一個非酶蛋白HbpA。其分子量為24.94 kD，含有一個SLH和一個黏附域，其黏附域和CbpA的黏附域相似。研究結(jié)果表明，HbpA既可以通過其上的SLH連接到C. cellulovorans的細(xì)胞壁上，又可結(jié)合纖維體酶和多糖底物，如纖維素、幾丁質(zhì)和木聚糖［17]。

1.2 纖維體纖維素酶和非纖維體纖維素酶

C. cellulovorans能合成纖維體纖維素酶和非纖維體纖維素酶兩種，非纖維體酶基因上不存在塢因子序列，而纖維體酶一般含有塢因子序列（22個氨基酸的重復(fù)序列）。C. cellulovorans的纖維體酶基因大部分位于纖維體基因簇上，編碼的纖維體酶包括1個外切葡聚糖酶（ExgS）、5個內(nèi)切葡聚糖酶（EngH、EngK、EngL、EngM和EngN）和1個甘露聚糖酶（ManA）。除了上述7種酶組分，纖維體酶還包括2個內(nèi)切葡聚糖酶EngB、EngE［18]（同時也具有木聚糖酶活性）、1個果膠酸酯酶（EngY-PelA）［19]和1個木聚糖酶（XynA）［20]，只是編碼這幾種酶的基因位于染色體的其他位置而非纖維體基因簇上，并且這幾個酶基因互不相連。最近，Han［21]又分離和表達了一種新的木聚糖酶基因xynB。另外，Jeon等［22]檢測到一種新的內(nèi)切葡聚糖酶EngZ，但此內(nèi)切酶具有很強的降解結(jié)晶纖維素活性。所有酶亞單位上的塢因子高度保守。除了塢因子，每個酶亞單位還包含催化域和信號肽，但是CBD和類Ig域并非每個酶亞單位都有。C. cellulovorans纖維體酶亞單位的種類繁多使得合成的纖維體能有效降解植物細(xì)胞壁的所有組分纖維素、木聚糖、甘露寡糖和果膠。

C. cellulovorans不僅能合成纖維體纖維素酶，還能產(chǎn)生游離纖維素酶——EngD（內(nèi)切葡聚糖酶、木聚糖酶）和EngF（內(nèi)切葡聚糖酶、纖維糊精酶）。engD和engB基因有較高的同源性［23]。

2 纖維體基因簇

C. cellulovorans纖維體基因簇含有9個相連基因，順序為cbpA-exgS-engH-engK-hbpA-engL-manA-engM-engN，總基因長22 kb（圖2）。此纖維體基因簇的5'端固定有非纖維體操縱子，由nifV-orf1-sigX-regA基因組成，3'端跟隨的是與轉(zhuǎn)座酶基因（trp）、蘋果酸酯酶基因（mle）有同源性的非纖維體基因［24]。最近研究者還發(fā)現(xiàn)了engL基因簇并對其進行了測序，結(jié)果顯示，engL基因簇包括5個不同的開放閱讀框，包含編碼ManA的基因序列［25]。除了C. cellulovorans纖維體，在C. cellulolyticum和C. josui纖維體中還發(fā)現(xiàn)了纖維體基因簇，但并未在C.thermocellum中發(fā)現(xiàn)纖維體基因簇，因此研究者推測，染色體上的纖維體基因簇是嗜溫梭狀芽孢桿菌的典型特點。

圖2 Clostridium cellulovorans纖維體基因

3 纖維體基因的表達調(diào)控

研究者通過將C.cellulovorans培養(yǎng)在不同的基質(zhì)中研究纖維體上的纖維素酶基因和半纖維素酶基因表達的調(diào)控因素［26，27]。當(dāng)培養(yǎng)基中含有纖維二糖和纖維素中，纖維素基因（engE）和半纖維素基因（xynA）共表達；基質(zhì)中纖維素、木聚糖和果膠的存在，使得纖維體中大部分的基因得到表達；而將纖維二糖和果糖作為碳源的時候，cbpA、engH、manA、engE和xynA的表達減弱；將碳源換為葡萄糖、半乳糖、麥芽糖和蔗糖等可溶單糖或二糖的時候，cbpA、engH、manA、engE和xynA基本不表達。xynA基因和pelA基因只有基質(zhì)中分別含木聚糖和果膠的時候才會特異性表達。根據(jù)這些結(jié)果研究者推測出纖維素酶基因和半纖維素酶基因之間存在協(xié)同表達，在纖維素酶基因表達過程中可能存在一種降解物阻遏調(diào)控機制。

Cho等［28]的研究結(jié)果顯示，當(dāng)碳源為微晶纖維素和AXP（微晶纖維素-木聚糖-果膠，3∶1∶1）時，EngE、ExgS、EngK、XynB和ManA都表達，但是，EngY只在AXP培養(yǎng)基中才能檢測到。Han等［29]還觀察了C.cellulovorans培養(yǎng)在不同基質(zhì)中纖維體與非纖維體酶的mRNA和蛋白表達的變化，以此理解纖維體和非纖維體水解酶之間的協(xié)同作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在多種碳源底物（纖維素、果膠、木聚糖、纖維二糖和玉米纖維）中纖維體和非纖維體酶都有協(xié)同活性。與非纖維體酶相比，碳源對纖維體的蛋白質(zhì)組學(xué)影響更大。纖維素、果膠和木聚糖的混合物可以誘導(dǎo)多種酶表達。

4 Clostridium cellulovorans纖維體基因工程研究進展

在過去幾年中研究者已對纖維體中纖維素酶各亞單位基因engB、engE、engH、engK、engL、engM、engY、exgS、木聚糖酶基因xynA、甘露聚糖酶基因manA及果膠酶基因pelA進行了克隆和測序，并已經(jīng)研究不同組分之間對降解植物細(xì)胞壁的協(xié)同效應(yīng)，包括纖維素酶亞單位之間的協(xié)同［30]、纖維素酶亞單位和半纖維素酶亞單位之間的協(xié)同［31，32]及纖維體纖維素酶與非纖維體纖維素酶之間的協(xié)同［33]。在這些協(xié)同效應(yīng)的研究中，構(gòu)建mini-cellulosome是一種有效的方法。如，Jeson等［34]設(shè)計mini-celluloso-me研究EngE和ManB對半乳甘露聚糖降解的協(xié)同作用。這些研究也為體外構(gòu)建重組高活性的或有特定功能的mini-cellulosome做足了準(zhǔn)備。minicellulosome是目前的研究熱點，是由mini-CbpA和一種或幾種不同的酶組合成的小復(fù)合物。mini-CbpA上的黏附域可以是種特異性的，也可以是來自不同種的黏附域，種特異性的黏附域只能結(jié)合來自同種的酶，而后者的黏附域可以結(jié)合那些種的同源酶。mini-cellulosome和 mini-CbpA示意圖分別見圖3，圖4。當(dāng)腳手架蛋白CbpA基因在E. coli中表達時，得到的是不同大小的蛋白片段（9個），因為CbpA上的9個黏附域兩兩之間被切割開，所以得不到完整的CbpA蛋白。因此，Murashima等［35]分別將engB基因克隆轉(zhuǎn)入Bacillus subtilisWB800菌株，將minicbpA基因轉(zhuǎn)化至E. coli中表達。最后，將純化的含有塢因子的活性木聚糖酶和mini-CbpA兩部分體外聚集構(gòu)成mini-cellulosome。在隨后的研究中，Cho等［36]又將這兩部分的基因串聯(lián)融合，使得兩種基因在Bacillus subtilisWB800共表達以進行體內(nèi)聚集構(gòu)建mini-cellulosome。這種體內(nèi)體外構(gòu)建minicellulosome的方法為得到高活性的多功能纖維素酶提供思路。Lilly等［37]實現(xiàn)了mini-cellulosome在釀酒酵母系統(tǒng)中的成功表達，增加了成功構(gòu)建具有纖維素水解活性的啤酒酵母菌株的可行性。Hyeon等［38]構(gòu)建了釀酒酵母工程菌，異源表達C.cellulovorans的mini-CbpA和C.thermocellum的內(nèi)切葡聚糖酶CelE基因，在體內(nèi)聚集成mini-cellulosome，同時在表達的葡萄糖苷酶的協(xié)助下發(fā)酵纖維質(zhì)生產(chǎn)乙醇，實現(xiàn)了一步加工纖維質(zhì)的目的，這種途徑將大大降低生產(chǎn)成本。為了相同的目的，Jeon等［39]構(gòu)建釀酒酵母工程菌，只是簡單的表達C.cellulovorans的EngD和Saccharomycopsis fibuligera的β-葡萄糖苷酶基因，沒有構(gòu)建mini-cellulosome。

研究者還對改善纖維體酶的生物學(xué)特性進行了相關(guān)研究。如Murashima［40]用“分子育種”技術(shù)將engB基因和engD基因體外重組，得到了熱穩(wěn)定性比兩種母本酶都提高并且活性不變的酶分子。Lee［41]將engD基因和Clostridium thermocellum的纖維體纖維素酶基因celE體外重組，大大提高了內(nèi)切葡聚糖酶EngD的熱穩(wěn)定性和水解活性。另外，為搞清纖維體水解多糖的分子機制，研究者最近對幾種梭菌進行了全基因組分析。Tamaru等［42]完成了C.cellulovorans743B（ATCC35296）的全基因組測序工作?；蚪M分析結(jié)果顯示，C.cellulovorans基因組包括57個纖維體基因和大量的編碼非纖維體酶基因［43]。纖維體基因不僅編碼纖維素酶、脂肪酶和肽酶，還發(fā)現(xiàn)了兩種新的腳手架蛋白CbpB和CbpC。另外，C.cellulovorans基因組分析結(jié)果顯示，纖維體中還含有3個蛋白酶/肽酶抑制劑——cyspin 1、cyspin 2和 cyspin 3。Meguro等［44]的研究結(jié)果首次展示了3個蛋白酶/肽酶抑制劑的功能，即保護纖維體和產(chǎn)纖維體的微生物免遭植物蛋白酶的降解，保證纖維體對植物的降解順利進行。

5 小結(jié)

研究者對嗜纖維梭菌纖維體系統(tǒng)進行近20年的研究成果為其他纖維體的研究提供了基本信息。歸因于纖維體中糖基水解酶的多樣性、水解酶之間的協(xié)同作用和纖維體與底物的緊密黏合，纖維體能高效降解植物細(xì)胞壁中的纖維素、半纖維素和幾丁質(zhì)等組分。對纖維體的基礎(chǔ)研究會促進生物反應(yīng)器和生物傳感器的發(fā)展。纖維體的應(yīng)用可提高飼料的消化利用率，還可將纖維素類物質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)榭砂l(fā)酵糖，以此產(chǎn)生可再生燃料如乙醇，為人們尋找再生性能源提供途徑。提高纖維體的產(chǎn)量和纖維體的水解效率等都將會擴展纖維體的應(yīng)用范圍，但是如何提高目前還沒有取得進展，有待于深入研究。

［1] Doi RH, Kosugi A. Cellulosomes：plant-cell-wall-degradingenzyme complexes［J].Nat Rev Microbiol, 2004, 2（7）：541-551.

［2] Doi RH, Kosugi A, Murashima K, et al. Cellulosomes from mesophilic bacteria［J] . J Bacteriol, 2003, 185（20）：5907.

［3] Ding SY, Bayer EA, Steiner D, et al. A scaffoldin of theBacteroides cellulosolvenscellulosome that contains 11 type II cohesins［J] .Journal of Bacteriology, 2000, 182（17）：4915.

［4] Sleat R, Mah RA, Robinson R. Isolation and characterization of an anaerobic, cellulolytic bacterium,Clostridium cellulovoranssp.nov［J] . Appli Environ Microbiol, 1984, 48（1）：88.

［5] Lamed R, Setter E, Bayer EA. Characterization of a cellulose-binding,cellulase-containing complex inClostridium thermocellum［J] .Journal of Bacteriology, 1983, 156（2）：828.

［6] Pages S, Belaich A, Belaich JP, et al. Species-specificity of the cohesin-dockerin interaction betweenClostridium thermocellumandClostridium cellulolyticum：Prediction of specificity determinants of the dockerin domain［J] . Proteins, 1997, 29（4）：517-527.

［7] Kakiuchi M, Isui A, Suzuki K, et al. Cloning and DNA sequencing of the genes encodingClostridium josuiscaffolding protein CipA and cellulase CelD and identification of their gene products as major components of the cellulosome［J] . J Bacteriol, 1998, 180（16）：4303.

［8] Pohlschroder M, Leschine SB, Canale-Parola E. Multicomplex cellulase-xylanase system ofClostridium papyrosolvensC7［J] .Journal of Bacteriology, 1994, 176（1）：70.

［9] Ding SY, Rincon MT, Lamed R, et al. Cellulosomal scaffoldinlike proteins fromRuminococcus flavefaciens［J] . Journal of Bacteriology, 2001, 183（6）：1945.

［10] Ohara H, Karita S, Kimura T, et al. Characterization of the cellulolytic complex （cellulosome） fromRuminococcus albus［J] .Biosci, Biotechnol Biochem, 2000, 64（2）：254-260.

［11] Doi RH, Tamaru Y. TheClostridium cellulovoranscellulosome：an enzyme complex with plant cell wall degrading activity［J] .Chemical Record, 2001, 1（1）：24-32.

［12] Fontes CM, Gilbert HJ. Cellulosomes：highly efficient nanomachines designed to deconstruct plant cell wall complex carbohydrates［J] . Annu Rev Biochem, 2010, 79：655-681.

［13] Doi RH. Cellulases of mesophilic microorganisms：cellulosome and noncellulosome producers［J] . Annals of the New York Academy of Sciences, 2008, 1125（1）：267-279.

［14] Shoseyov O, Takagi M, Goldstein MA, et al. Primary sequence analysis ofClostridium cellulovoranscellulose binding protein A［J] .Proc Nat Acad Sci USA, 1992, 89（8）：3483.

［15] Goldstein MA, Takagi M, Hashida S, et al. Characterization of the cellulose-binding domain of theClostridium cellulovoranscellulosebinding protein A［J] . J Bacteriol, 1993, 175（18）：5762.

［16] Park JS, Matano Y, Doi RH. Cohesin-dockerin interactions of cellulosomal subunits ofClostridium cellulovorans［J].Journal of Bacteriology, 2001, 183（18）：5431.

［17] Matsuoka S, Yukawa H, Inui M, et al. Synergistic Interaction ofClostridium cellulovoransCellulosomal Cellulases and HbpA［J] .Journal of Bacteriology, 2007, 189（20）：7190.

［18] Tamaru Y, Doi RH. Three surface layer homology domains at the N terminus of theClostridium cellulovoransmajor cellulosomal subunit EngE［J] . J Bacteriol, 1999, 181（10）：3270.

［19] Tamaru Y, Doi RH. Pectate lyase A, an enzymatic subunit of theClostridium cellulovoranscellulosome［J] . Proceedings of the National Academy of Sciences, 2001, 98（7）：4125.

［20] Kosugi A, Murashima K, Doi RH. Xylanase and acetyl xylan esterase activities of XynA, a key subunit of theClostridium cellulovoranscellulosome for xylan degradation［J].Applied and Environmental Microbiology, 2002, 68（12）：6399.

［21] Han SO, Yukawa H, Inui M, et al. Isolation and expression of the xynB gene and its product, XynB, a consistent component of theClostridium cellulovoranscellulosome［J] . Journal of Bacteriology, 2004, 186（24）：8347.

［22] Jeon SD, Yu KO, Kim SW, et al. The processive endoglucanase EngZ is active in crystalline cellulose degradation as a cellulosomal subunit ofClostridium cellulovorans［J].New Biotechnology, 2012, 29（3）：365-371.

［23] Foong F, Doi R. Characterization and comparison ofClostridium cellulovoransendoglucanases-xylanases EngB and EngD hyperexpressed inEscherichia coli［J] . J Bacteriol, 1992, 174（4）：1403.

［25] Tamaru Y, Karita S, Ibrahim A, et al. A large gene cluster for theClostridium cellulovoranscellulosome［J] . Journal of Bacteriology,2000, 182（20）：5906.

［26] Han SO, Yukawa H, Inui M, et al. Regulation of expression of cellulosomal cellulase and hemicellulase genes inClostridium cellulovorans［J] . Journal of Bacteriology, 2003, 185（20）：6067.

［27] Bayer EA, Belaich JP, Shoham Y, et al. The cellulosomes：multienzyme machines for degradation of plant cell wall polysaccharides［J] . Annual Review of Microbiology, 2004, 58：521-554.

［28] Cho W, Jeon SD, Shim HJ, et al. Cellulosomic profiling produced byClostridium cellulovoransduring growth on different carbon sources explored by the cohesin marker［J] . Journal of Biotechnology,2010, 145（3）：233-239.

［29] Han SO, Cho HY, Yukawa H, et al. Regulation of expression of cellulosomes and noncellulosomal （hemi） cellulolytic enzymes inClostridium cellulovoransduring growth on different carbon sources［J] . Journal of Bacteriology, 2004, 186（13）：4218.

［30] Murashima K, Kosugi A, Doi RH. Synergistic effects on crystalline cellulose degradation between cellulosomal cellulases fromClostridium cellulovorans［J] . J Bacteriol, 2002, 184（18）：5088.

［31] Murashima K, Kosugi A, Doi RH. Synergistic effects of cellulosomal xylanase and cellulases fromClostridium cellulovoranson plant cell wall degradation［J] . J Bacteriol, 2003, 185（5）：1518.

［32] Koukiekolo R, Cho HY, Kosugi A, et al. Degradation of corn fiber byClostridium cellulovoranscellulases and hemicellulases and contribution of scaffolding protein CbpA［J] . Applied and Environmental Microbiology, 2005, 71（7）：3504.

［33] Kosugi A, Murashima K, Doi RH. Characterization of two noncellulosomal subunits, ArfA and BgaA, fromClostridium cellulovoransthat cooperate with the cellulosome in plant cell wall degradation［J] . Journal of Bacteriology, 2002, 184（24）：6859.

［34] Jeon SD, Yu KO, Kim SW, et al. A celluloytic complex fromClostridium cellulovoransconsisting of mannanase B and endoglucanase E has synergistic effects on galactomannan degradation［J].Applied Microbiology and Biotechnology, 2011, 90：565-572.

［35] Murashima K, Chen CL, Kosugi A, et al. Heterologous production ofClostridium cellulovoransengB, using protease-deficientBacillus subtilis, and preparation of active recombinant cellulosomes［J] .Journal of Bacteriology, 2002, 184（1）：76.

［36] Cho HY, Yukawa H, Inui M, et al. Production of minicellulosomes fromClostridium cellulovoransinBacillus subtilisWB800［J] .Applied and Environmental Microbiology, 2004, 70（9）：5704.

［37] Lilly M, Fierobe HP, Van Zyl WH, et al. Heterologous expression of aClostridiumminicellulosome inSaccharomyces cerevisiae［J] .Fems Yeast Research, 2009, 9（8）：1236-1249.

［38] Hyeon J, Yu KO, Suh DJ, et al. Production of minicellulosomes fromClostridium cellulovoransfor the fermentation of cellulosic ethanol using engineered recombinantSaccharomyces cerevisiae［J] .Fems Microbiology Letters, 2010, 310（1）：39-47.

［39] Jeon E, Sung EL, Park BS, et al. Cellulosic alcoholic fermentation using recombinantSaccharomyces cerevisiaeengineered for the production ofClostridium cellulovoransendoglucanase and Saccharomycopsis fibuligeraβ-glucosidase［J].Fems Microbiology Letters,2009, 301（1）：130-136.

［40] Murashima K, Kosugi A, Doi RH. Thermostabilization of cellulosomal endoglucanase EngB fromClostridium cellulovoransby in vitro DNA recombination with non-cellulosomal endoglucanase EngD［J] . Molecular Microbiology, 2002, 45（3）：617-626.

［41] Lee CY, Yu KO, Kim SW, et al. Enhancement of the thermostability and activity of mesophilicClostridium cellulovoransEngD by in vitro DNA recombination withClostridium thermocellumCelE［J] . J Bioscience and Bioeng, 2010, 109（4）：331-336.

［42] Tamaru Y, Miyake H, Kuroda K, et al. Genome sequence of the cellulosome-producing mesophilic organismClostridium cellulovorans743B［J].Journal of Bacteriology, 2010, 192（3）：901.

［43] Tamaru Y, Miyake H, Kuroda K, et al. Comparative genomics of the mesophilic cellulosome-producingClostridium cellulovoransand its application to biofuel production via consolidated bioprocessing［J].Environmental Technology, 2010, 31（8-9）：889-903.

［44] Meguro H, Morisaka H, Kuroda K, et al. Putative role of cellulosomal protease inhibitors inClostridium cellulovoransby their gene expression and measurement of the activities［J].Journal of Bacteriology, 2011, 193（19）：5527-5530.