陳海云 陳少瑜 寧德魯 李瑞 李勇杰 毛云玲 吳濤

油橄欖（Olea euyopaea L.）為木犀科（Oleaceae）木犀欖屬（Olea Linn.）植物，原產(chǎn)于小亞細(xì)亞和敘利亞及其東部鄰近地區(qū)，后擴(kuò)展到希臘，是地中海地區(qū)重要的亞熱帶常綠果樹和木本油料樹種。油橄欖品種繁多，據(jù)統(tǒng)計(jì)，世界各地油橄欖自產(chǎn)品種共計(jì)1275個，中國現(xiàn)有登記品種共158個［1］。我國于1964年開始油橄欖的引種，之后開展了大量的栽培和品種選育等方面的研究［2］，但由于引種的渠道較多、管理不夠完善，加上長期的人工選育，使得品種同名異物、同物異名的現(xiàn)象較為嚴(yán)重，給生產(chǎn)和科研帶來很多不便，采用分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行油橄欖品種鑒定、分類和遺傳多樣性研究，探討品種間的親緣關(guān)系，對油橄欖品種資源的規(guī)范管理以及進(jìn)一步遺傳育種有重要意義。

近年來，國外已有一些采用RAPD，AFLP，SSR和ISSR等分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行油橄欖品種鑒定和遺傳多樣性研究的報(bào)道［3-7］，而國內(nèi)這方面的研究還非常缺乏。僅見邱源等［8］采用RAPD技術(shù)對23個引種的油橄欖品種進(jìn)行分類和鑒定研究，以及馬萬里等［9］運(yùn)用RAPD技術(shù)進(jìn)行了澳大利亞油橄欖品種的鑒定研究。鑒于此，本研究擬采用成本低、穩(wěn)定高、操作簡單、重復(fù)性強(qiáng)的ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對云南省永仁縣油橄欖品種資源收集圃中的48個油橄欖引種和選育品種進(jìn)行遺傳多樣性和聚類分析，為這些油橄欖品種資源的規(guī)范管理、進(jìn)一步的開發(fā)利用和良種選育提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

分析材料來源于收集種植在云南省楚雄州永仁縣油橄欖品種資源收集圃的48個油橄欖品種（表1），其中包括35個引種品種（1-35），13個國內(nèi)選育品種（36-48）。以嫩葉為提取基因組DNA的材料。采集嫩葉后放入裝有硅膠的自封袋中，帶回實(shí)驗(yàn)室置-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取及質(zhì)量檢測 采用植物基因組DNA提取試劑盒（Tiangen）提取48個油橄欖品種的基因組DNA，0.8 ％瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的DNA，具體方法見文獻(xiàn)［10］。

1.2.2 ISSR-PCR擴(kuò)增 擴(kuò)增體系：總體積20μL中含1×Taq Buffer，3.5mmol/L Mg2+，0.4mmol/L dNTPs，1.0 μmol/L 引物，1.0U Taq DNA聚合酶，20 ng DNA模板；反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，50-55℃退火30s，72℃延伸2min，40循環(huán)；72℃延伸10min，4℃保存。用篩選出的清晰穩(wěn)定、多態(tài)性強(qiáng)的11條引物（北京奧科鼎盛生物技術(shù)有限公司合成）對48個品種樣品進(jìn)行擴(kuò)增。各引物的序列、退火溫度見表2。擴(kuò)增產(chǎn)物于2.0％的瓊脂糖凝膠電泳，電泳緩沖液為0.5×TBE，電泳電壓為4 V/cm，電泳結(jié)束后在凝膠紫外成像儀上觀察、拍照。

1.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與遺傳分析 根據(jù)DNA Marker判讀電泳圖譜中擴(kuò)增條帶的分子量大小及有無，同一位點(diǎn)有條帶的記為“1”，無條帶的記為“0”。采用Excel軟件對膠板樣本條帶進(jìn)行轉(zhuǎn)化，構(gòu)建0/1數(shù)據(jù)矩陣。以Excel軟件的數(shù)據(jù)記錄為基礎(chǔ)，利用DCFA1.1軟件將ISSR譜帶統(tǒng)計(jì)結(jié)果轉(zhuǎn)換為POPGENE軟件適用文件，根據(jù)POPGENE計(jì)算得到的Nei’s遺傳距離和遺傳相似性系數(shù)，基于各樣本的遺傳距離或遺傳相似性系數(shù)數(shù)據(jù)，運(yùn)用NTSYSpc 2.10軟件進(jìn)行所有樣本的UPGMA聚類。

2 結(jié)果

2.1 ISSR-PCR擴(kuò)增結(jié)果

用篩選出的11條ISSR引物對48個樣品進(jìn)行擴(kuò)增，圖1為引物826和引物866對部分樣品的擴(kuò)增圖譜；擴(kuò)增的統(tǒng)計(jì)結(jié)果列于表2。由表2可見，11條引物一共擴(kuò)增出106條DNA譜帶，平均每條引物擴(kuò)增9.63條帶。各條引物擴(kuò)增的條帶數(shù)3-16條不等，其中引物UBC-826擴(kuò)增的條帶數(shù)最多（16條），引物UBC852的最少，僅有3條。擴(kuò)增的條帶分布在300-2 600bp之間，主要分布區(qū)間為500-1500bp。由擴(kuò)增圖譜（圖1）可以直觀看到，所有樣品有相同的擴(kuò)增位點(diǎn)，也有范圍較廣的特異擴(kuò)增位點(diǎn)，一定程度上說明所分析的油橄欖品種間的同源性，以及其遺傳背景的復(fù)雜性和多樣性。

2.2 遺傳多樣性狀況

圖1 引物826（A）和866（B）對部分油橄欖樣品的ISSR擴(kuò)增圖譜

由表2可見，106個擴(kuò)增位點(diǎn)中有99個為多態(tài)性位點(diǎn)，總的多態(tài)位點(diǎn)百分率為93.40％。其中UBC-814、UBC-816、UBC-826和UBC-874等 4條引物擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)位點(diǎn)百分率皆為100％，引物UBC-852擴(kuò)增的位點(diǎn)數(shù)最少，多態(tài)百分率也最低，僅有66.67％。可見，云南永仁縣油橄欖品種資源收集圃中收集的油橄欖品種資源具備了較高的遺傳多樣性和豐富的遺傳基礎(chǔ)。

表1 48個油橄欖品種原產(chǎn)地、來源及主要用途

表2 用以ISSR擴(kuò)增的11條引物序列、退火溫度及對59個品種的擴(kuò)增結(jié)果

2.3UPGMA聚類結(jié)果

根據(jù)POPGENE計(jì)算得到各品種的Nei’s遺傳距離和遺傳相似性系數(shù)，運(yùn)用NTSYSpc 2.10軟件進(jìn)行所有品種的UPGMA聚類（圖2）。圖中以遺傳距離0.171處作一結(jié)合線，可以將所有48個品種分成4個大類：第Ⅰ類有6個品種，除來源于達(dá)州的奧托卡和米扎兩個引種品種外，其他4個品種皆為昆明本地選育的品種，包括3個雜交品種和1個親本，這一類又可分為2個亞類Ⅰ-ⅰ和Ⅰ-ⅱ，每個亞類各包含了3個品種。第Ⅱ大類包含有主要來源于希臘和武都的13個引種品種以及大部分國內(nèi)選育品種（7個）的共20個品種，其中國內(nèi)選育的7個品種全部歸并于Ⅱ-ⅰ亞類中，直接引種于希臘的柯基、柯基優(yōu)、貝翠麗-p和貝翠麗-t全部聚在了Ⅱ-ⅱ亞類中。第Ⅲ類僅包含皮瓜爾、格羅桑、皮削利和沃麗4個品種。第Ⅳ大類共有18個品種，其中16個為引種品種，主要來源于希臘和廣元，只有2個品種（城固31和城固32）為國內(nèi)選育的品種。這一大類在0.150出被分成了4個亞類，Ⅳ-ⅰ僅有莫約拉1個品種；Ⅳ-ⅱ包含切拉姆、城固32、城固31、卡林和愛桑5個品種，國內(nèi)選育的2個品種在此亞類中；Ⅳ-ⅲ亞類包含有12個品種，全部都是引種品種，直接引種于希臘的7個品種全部歸類于其中。

3 討論

本研究用篩選出的11條ISSR引物對48個樣品進(jìn)行擴(kuò)增，在全部106個擴(kuò)增位點(diǎn)中有99個為多態(tài)性位點(diǎn)，總的多態(tài)位點(diǎn)百分率為93.40％，數(shù)據(jù)表明油橄欖品種間的多態(tài)性比較高。這可能是廣泛的種質(zhì)起源以及漫長的進(jìn)化和長期的人工選育的結(jié)果［11］，這一結(jié)果從分子水平上初步證明了油橄欖種質(zhì)廣泛和復(fù)雜的遺傳背景。另一方面也揭示了云南永仁縣油橄欖品種資源收集圃中收集的油橄欖品種資源具備豐富的遺傳基礎(chǔ)，這些資源為進(jìn)一步油橄欖種質(zhì)的開發(fā)和利用提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。

圖2 48個油橄欖品種的UPGMA聚類

根據(jù)各品種的Nei’s遺傳距離（或遺傳相似性系數(shù)），進(jìn)行所有品種的UPGMA聚類，結(jié)果48個油橄欖品種被聚成了4個大類，其中第Ⅰ大類包含2個亞類，第Ⅱ大類包含2個亞類，第Ⅲ大類僅有1個亞類，第Ⅳ大類包含3個亞類。對各大類及亞類的品種進(jìn)一步分析，國內(nèi)選育品種基本聚類于2個類群中，其中3個雜交品種及其親本位于第Ⅰ大類（占30.8％），7個品種（占53.8％）聚類于Ⅱ-ⅰ亞類中，這2個類群中國內(nèi)選育品種占到了總數(shù)的84.6％，只有15.4％的國內(nèi)選育品種（2個）列于Ⅳ-ⅱ亞類中；另外，從聚類結(jié)果看，大多數(shù)引種品種并沒有按照地理起源（原產(chǎn)地）而更多是依據(jù)引種材料來源地和主要用途來聚類的，例如第Ⅱ大類中的品種主要來源于武都和希臘，而第Ⅳ大類的品種材料主要來源于希臘和廣元；著名的果用品種超克、貝拉聚于Ⅳ-ⅲ亞類中，盧克斯和阿斯聚于Ⅱ-ⅰ亞類中?？梢姡诼L的人類利用油橄欖種質(zhì)資源的過程中，由于廣泛、復(fù)雜的引種和選育，造成以生長、經(jīng)濟(jì)性狀和抗性等為主要目標(biāo)的選擇和引種壓力和油橄欖種質(zhì)間頻繁的基因交流，進(jìn)而導(dǎo)致本研究的聚類結(jié)果。這一結(jié)果與Claros等［12］、Besnard等［13］、Rotondi 等［14］和 Hagidinitrious 等［4］的研究結(jié)果相似，他們分別對希臘和意大利主栽品種進(jìn)行了RAPD、AFLP、SSR及聚類分析，結(jié)果表明由于不同地域間頻繁的品種交換，導(dǎo)致劃分的類群與其地理起源沒有明顯的關(guān)系，而與果實(shí)的大小和用途明顯相關(guān)。在油橄欖的雜交育種實(shí)踐工作中可以借鑒本項(xiàng)研究的聚類結(jié)果，即選擇親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的育種材料為親本，以選育出更為優(yōu)勢、更符合當(dāng)?shù)匕l(fā)展的油橄欖優(yōu)良品種。

4 結(jié)論

本研究采用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對云南省永仁縣油橄欖品種資源收集圃中收集的48個油橄欖品種資源進(jìn)行了遺傳多樣性和UPGMA聚類分析，研究結(jié)果表明，所收集的油橄欖品種具有豐富的遺傳多樣性（多態(tài)位點(diǎn)百分率達(dá)93.40％），基于遺傳距離的UPGMA聚類表明大多數(shù)引種品種并沒有按照地理起源（原產(chǎn)地），而主要是根據(jù)引種材料來源地和主要用途進(jìn)行聚類的。

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