石小彤 李彥芹 邢國偉 康現(xiàn)江

近年來，生物脫氮在廢水處理中因其高效、管理成本低、無二次污染而成為污水凈化研究的熱點，氮素的去除由硝化和反硝化兩個過程來完成。硝化作用一般在好氧條件下進行，傳統(tǒng)認為細菌的反硝化是一個嚴格的厭氧過程，反硝化作用是硝態(tài)氮或亞硝態(tài)氮被還原成含氮氣體（NO，N2O）及氮氣的過程。反硝化反應過程中，可能存在兩種轉化途徑，一種為同化反硝化（合成），形成有機氮化合物，將其轉化為菌體的組成部分；另一種為異化反硝化（分解），最終產物是氣態(tài)氮，或者其它氣態(tài)氮氧化物［1］。自 Robertson等［2］首次發(fā)現(xiàn)了好氧反硝化細菌Thiosphaera pantotroph后，好氧反硝化菌株已在很多報道中出現(xiàn)，如 Pseudomonas aeruginosa［3］、Pseudomonas chloritidismutans［4］、Alcaligenes piechaudii［5］、Bacillus licheniform［6］等。好氧反硝化細菌的存在使得硝化與反硝化得以在同一個反應器里面進行，降低運行成本，硝化反應的底物可直接成為反硝化反應的底物，加速了硝化反應的過程，同時反硝化反應釋放的OH-會補償硝化反應消耗的堿，避免酸性物質的積累，維持pH值穩(wěn)定［7］。

目前海水水質處理中針對亞硝酸鹽還原的好氧反硝化細菌相關報道較少，好氧反硝化細菌大多是從淡水環(huán)境中分離得來。本試驗在鹽度為33的情況下篩選出一株對硝酸鹽和亞硝酸鹽具有較強反硝化作的菌株，以期為好氧反硝化細菌在海水水產養(yǎng)殖水質改良方面提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 秦皇島對蝦養(yǎng)殖池底泥。

1.1.2 培養(yǎng)基

1.1.2.1 反硝化富集分離培養(yǎng)基（DM）（g/L）Na2-HPO4·7H2O 7.9，KH2PO41.5，NH4Cl 0.3，KNO32.0，MgSO4·7H2O 0.1，琥珀酸鈉 4.7，NaNO20.5，NaCl 33.0，微量元素溶液2mL［微量元素溶液配方（g/L）：EDTA 50.0，ZnSO42.2，CaCl25.5，MnCl2·4H2O 5.06，F(xiàn)eSO4·7H2O 5.0，CuSO4·5H2O 1.57，（NH4）6-Mo7O24·4H2O 1.1，CoC12·6H2O 1.61，pH7.0-7.5］。

1.1.2.2 初篩培養(yǎng)基（BTB）［8］（g/L）KNO31.0，KH2PO41.0，F(xiàn)eCl3·6H2O 0.05，CaCl2·2H2O 0.2，瓊脂 15.0，MgSO4·7H2O 1.0，1mL BTB，NaCl 33.0，pH7.0-7.3。

1.1.2.3 細菌培養(yǎng)基（g/L）牛肉膏3.0，蛋白胨10.0，H2O 1L，NaCl 33.0，pH7.0-7.2。

1.1.2.4 反硝化性能測試培養(yǎng)基（g/L）A：細菌培養(yǎng)基+ KNO30.5 g；B：細菌培養(yǎng)基+ NaNO20.5 g。

1.2 方法

1.2.1 分離方法

1.2.1.1 初篩 取活性污泥1 g接種到裝有200mL滅菌的反硝化培養(yǎng)液的錐形瓶中，振蕩使其混勻，錐形瓶用紗布封口，搖床振蕩培養(yǎng)3d，轉速為130r/min，如此重復操作3次，以富集反硝化細菌。

富集完成后，取菌懸液進行BTB平板涂布，30℃溫箱培養(yǎng)2-3d，待菌落長出后，挑取藍色和藍色暈圈的單菌落，在固體細菌培養(yǎng)基上多次劃線純化，直至其有清晰的單菌落，無雜菌和伴生菌，將純化好的菌落轉接到試管斜面，溫箱靜置培養(yǎng)3 d后放冰箱4℃保存。

1.2.1.2 復篩 定性測試：將保存在斜面上的菌株接種到反硝化培養(yǎng)液中，室溫振蕩培養(yǎng)2-3 d。吸取少量菌液，滴加格里斯試劑和二苯胺試劑，進行顯色反應。將有顯色反應的菌株接種到反硝化培養(yǎng)基試管內，恒溫培養(yǎng)，觀察德漢氏小管內有無氣體。

定量測試：接種斜面菌株于細菌液體培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)48h作為種子，以2％的接種量轉接到200mL反硝化培養(yǎng)基中，搖床振蕩3 d后，取菌液檢測培養(yǎng)基的總氮含量，并計算總脫氮率，從中篩選出總脫氮率最高的一株菌株。接種該菌株于反硝化性能測試培養(yǎng)基A和B，30℃下130r/min振蕩培養(yǎng)，每隔10h檢測硝酸鹽和亞硝酸鹽濃度。

每個試驗重復3次，每組設置3個平行，未接種細菌的滅菌培養(yǎng)液作為空白樣。

1.2.2 分析方法 總氮（TN）采用堿性過硫酸鉀紫外線分光光度法檢測；硝酸氮（NO3--N）用紫外分光光度法檢測；亞硝酸氮（NO2--N）測定用N-（1-萘基）-乙二胺光度法［9］。測定TN時培養(yǎng)液不離心，直接稀釋測定，而測定NO3

--N和NO2--N時，培養(yǎng)液12000r/min離心10min，將菌體去除，取上清測定。

1.2.3 好氧反硝化細菌的鑒定

1.2.3.1 菌株形態(tài)學觀察 取有單菌落的培養(yǎng)皿，拍照得菌落照片，對篩選菌株進行革蘭氏染色，將染色后的細菌于顯微鏡下觀察。

1.2.3.2 菌體生長曲線 吸光度法用721分光光度計在光波長為660nm處測量吸光度值。在溫度為30℃、接種量為2％、120r/min搖床振蕩培養(yǎng)，每隔6h采樣測定菌液OD值。

1.2.3.3 生理生化鑒定 參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》［10］。

1.2.3.4 菌株16S rDNA序列分析 將篩選所得菌株保存至斜面送交至北京基諾萊普生物技術有限公司測序，16S rDNA擴增引物：上游為27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'），下游引物為1492R（5'-AAGTCGTAACAAGGTAACC-3'），測序結果通過GenBank Blast進行比對分析。

2 結果

2.1 菌株的篩選

通過對細菌的富集分離純化及顯色反應，篩選得到35株菌株，編號為F1-F35。將這35株菌株接種到裝有德漢氏小管的反硝化培養(yǎng)基試管內，2周后有4個菌株內的德漢氏小管內有氣體。它們分別為F1、F14、F26和F29，說明這4株菌株能較好地降解硝酸鹽和亞硝酸鹽，反硝化過程較為徹底，反硝化作用較強。

圖1為菌株F1、F14、F26和F29的脫氮率，在3 d之內它們對培養(yǎng)基中總氮的消解率都達到了50％以上，沒有接入細菌的對照反硝化培養(yǎng)液（CK）總氮含量變化很少，這4株菌株中菌株F1的脫氮率最高，達到71.4％，其余3株分別為51.25％、55％和60.7％。由于TN測定中包含了微生物同化的氮，同時搖床震蕩確保了好氧條件，因此，本研究中總氮的減少主要源于微生物好氧反硝化作用所致，含氮量越低表明菌株降解能力越強，總氮的減少程度即代表了反硝化脫氮的效果。由此得知，菌株F1好氧反硝化脫氮效果最好。

圖1 不同菌株總氮的去除率比較

2.2 菌株的好氧反硝化特性

圖2 A培養(yǎng)基內和度變化

圖3 B培養(yǎng)基內和度變化

表1 培養(yǎng)基A和B中和濃度變化

表1 培養(yǎng)基A和B中和濃度變化

？

2.3 菌株的鑒定

2.3.1 菌株形態(tài)學觀察 菌株F1在細菌平板上，菌落形態(tài)為圓形，乳白色，邊緣整齊清晰，表面光滑，中心凸起，F(xiàn)1的單細胞呈短桿狀或桿狀，革蘭氏陰性（圖4）。

圖4 菌株F1光學及菌落圖

2.3.2 菌株生長曲線 菌株接種到液體細菌培養(yǎng)基后，細菌的生長會使澄清的培養(yǎng)液逐漸變渾濁，在特定波長下，菌懸液中的細菌數(shù)量與相應吸光度成正比。細菌生長曲線一般表現(xiàn)出4個不同的生長時期：遲緩期、對數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期。菌株F1生長曲線，如圖5所示。在好氧條件下，鹽度為33時，菌株F1的遲緩期很短，接種后迅速進入對數(shù)生長期，6-24h為菌株F1的指數(shù)生長期，24h后菌體濃度達到最高，進入穩(wěn)定期，48h后隨著培養(yǎng)時間的繼續(xù)延長，細菌吸光度降低。

圖5 菌株F1的生長曲線

2.3.3 菌株的生理生化鑒定 根據(jù)細菌菌落及菌體的形態(tài)特征結合其生理生化試驗（表2），初步推斷菌株F1為鹽單胞菌屬（Halomonas sp.）。

表2 菌株F1的生理生化功能鑒定

2.3.4 序列分析 將所測序列在 NCBI上進行Blast序列比對，結果顯示，菌株F1與Halomonas alimentaria的同源性最高，為99％，登錄號為NR_025054。由此可知，菌株F1屬于鹽單胞菌屬。采用MEGA4.1分析軟件，構建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖6）。

3 討論

反硝化細菌在分類學上并沒有專門的類群，而是分散于原核生物的眾多屬中。好氧反硝化現(xiàn)象僅在細菌中發(fā)現(xiàn)，主要存在于假單胞菌屬（Pseudomonas）、產堿桿菌屬（Alcaligenes）、副球菌屬（Paracoccus）和芽孢桿菌屬（Bacillus）等［11］。嗜鹽反硝化細菌數(shù)量較少，主要分布于細菌中的Bacillus、Halomonas及古細菌Halobacterium和Haloarcula等幾個屬中［12］。廖紹安［13］利用間歇曝氣選擇性富集，篩選到一株10h內將亞硝態(tài)氮由26.18mg/L降至0的好氧反硝化細菌，在鹽度為0-25之間20h內均可達到同樣的去除效果。Li［14］發(fā)現(xiàn)菌株GQ-42在鹽度為50-100內去除率保持在90％以上；當鹽度超過150，隨著鹽度的增大，去除率下降得較為明顯。鹽度對反硝化的活性可能有一定的影響。該試驗分離的菌株F1是一株能利用硝酸鹽和亞硝酸鹽的好氧反硝化菌，經過形態(tài)特征、生理生化試驗和16S rDNA序列分析，初步鑒定該菌株屬于鹽單胞菌屬。它與目前所報道的好氧反硝化菌均不相同，表現(xiàn)了自然界中好氧反硝化菌的生物多樣性，對揭示好氧反硝化菌的生態(tài)學有重要的意義。

圖6 菌株F1的系統(tǒng)發(fā)育樹

從圖2和圖3可以看出，不管氮源是硝酸鹽還是亞硝酸鹽，反硝化主要發(fā)生在0-30h之間。結合菌株的生長曲線，可以得出，好氧反硝化作用主要發(fā)生在對數(shù)生長期，而遲緩期、穩(wěn)定期和衰亡期和并沒有明顯的濃度變化，說明此期間并沒有明顯的反硝化過程。好氧反硝化作用主要發(fā)生在對數(shù)生長期，這是因為細菌在此期間生長速率最快，細胞代謝旺盛，細胞合成所需要的能量和還原力主要在這一階段被消耗，所以指數(shù)生長期是反硝化效率最高的時期，這與周丹丹等［15］報道的菌株情況相似。

水體中亞硝酸鹽濃度積累到一定程度后，將對水體中養(yǎng)殖的魚蝦類產生毒害，它主要是誘導血液中的血紅蛋白轉變?yōu)楦哞F血紅蛋白，抑制血液載氧能力，出現(xiàn)組織缺氧，甚至導致魚蝦類缺氧窒息而死。一般試驗中反硝化性能測試時常用硝酸鹽為氮源，而該試驗B培養(yǎng)基以為唯一氮源，培養(yǎng)基濃度由初始的32.79mg/L在70h后降低為0.93mg/L，降解率達到97.16％，此間亞硝態(tài)氮最高脫氮速率可為1.25mg/L·h（0-10h）。

影響反硝化脫氮率的因素有碳源、碳氮比、溶氧量、溫度、pH和初始氮濃度等，接下來將對該菌株在這些方面進行研究，得出最佳反硝化條件，為今后實現(xiàn)硝化反硝化工藝的研究提供依據(jù)。

4 結論

從對蝦養(yǎng)殖池底泥中分離純化得到4株好氧反硝化細菌，分別為F1、F14、F26和F29，其總氮去除率為71.4％、51.25％、55％和60.7％。菌株 F1在鹽度為33時，能有效降解硝酸鹽和亞硝酸鹽，40h內脫氮率達到86.82％和97.01％，是一株高效的反硝化細菌，反硝化過程主要發(fā)生在對數(shù)生長期，初步鑒定為鹽單胞菌。

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