孫曉東 王 燕 羅超 王 珺 桑 明，2▲

1.湖北醫(yī)藥學院基礎醫(yī)學研究所，湖北十堰 442000；2.武漢大學動物實驗中心/ABSL-3 Lab，湖北武漢 430071

核糖體失活蛋白（RIP）是一種能夠使真核細胞核糖體28s rRNA 第4 324位腺嘌呤糖苷鍵水解、斷裂，從而使真核細胞蛋白質合成受到不可逆抑制的蛋白，廣泛存在于絲瓜種子中。目前分離到的Luffin-a[1-3]、Luffin-b[4]以及新型小分子蛋白 Luffin-s[5]、Luffin-P1[6，7]均屬于Ⅰ型 RIP。進年來的研究發(fā)現(xiàn)，RIPs 能抑制HIV 病毒在急慢性感染的淋巴細胞和單核巨噬細胞中的復制，具有抗病毒、抗腫瘤、誘導細胞凋亡等生物活性[5，8]。本實驗成功構建Luffin-a的原核表達載體，對Luffin-a的體外表達做了初步研究。

1 材料與方法

1.1 材料

大腸桿菌TOP10 感受態(tài)細胞和BL21（DE3）pLys表達菌株及克隆載體pGM-T均購自TIANGEN公司，原核表達載體pET-15b（+）由湖北醫(yī)藥學院附屬人民醫(yī)院臨床醫(yī)學研究所贈送。Trizol 購自Invitrogen公司，逆轉錄試劑盒購自Promega公司，2 ×Taq PCR MasterMix、 質粒小提試劑盒、pGM-T 克隆試劑盒、DNA 純化回收試劑盒、DNA Marker D2000、D15000、DNA MarkerⅣ、IPTG 均購自TIANGEN公司，限制性內(nèi)切酶NdeⅠ和BamHⅠ購自Fermentas公司。

1.2 方法

1.2.1 提取總RNA 及cDNA 第一鏈合成 用Trizol 常規(guī)提取未成熟絲瓜種子總RNA，用50 μL DEPC H2O 溶解RNA樣品，紫外分光光度儀檢測RNA 樣品濃度與純度，-80℃保存?zhèn)溆?。? μg 總RNA 為模板，按逆轉錄試劑盒說明操作， 反應體系：oligdT 2 μL，10 mmol/L dNTP 1.25 μL，加入RNA 適量體積后用 DEPC H2O 補足體積至 18.5 μL，70℃反應5 min，立即插冰上；再加入逆轉錄酶mmlv（200 U/μL）1 μL，抑制劑 rRNasin（40 U/μL）0.5 μL，5×buffer 5 μL，使總反應體系為 25 μL，42℃反應 1 h，95℃反應 3 min 終止反應，cDNA 產(chǎn)物-20℃保存。

1.2.2 引物設計及Luffin-a 基因PCR 擴 增 根 據(jù)Pubmed 中檢索得到的Luffin-a 核酸序列，由上海生工設計合成一對引物，在正向引物5'端引入NdeⅠ酶切位點，在互補鏈引物5'端引入BamHⅠ酶切位點（斜體），上下游引物之間擴增產(chǎn)物長760 bp。上游引物：5'-gcccatatggatgtgaggttcagtttgtc-3'；下游引物：5'-ggcggatcctcacgcaacatt ttgtttgta-3'。PCR 反應體系：2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL，上游引物（10 μmol/L）0.5 μL，下游引物（10 μmol/L）0.5 μL，cDNA 5 μL，ddH2O 6.5 μL，94℃預變性 5 min，94℃變性 30 s，56℃退火30s，72℃延伸30s，30個循環(huán)，最后 72℃延伸 10min；PCR 產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.3 PCR 產(chǎn)物純化及Luffin-a表達載體的構建 根據(jù)DNA 純化回收試劑盒說明操作將PCR 產(chǎn)物進行純化，按照pGM-T 克隆試劑盒說明將Luffin-a 基因PCR 產(chǎn)物與pGM-T 載體連接，連接產(chǎn)物轉化感受態(tài)細胞TOP10，通過藍白斑篩選，挑取白色單克隆菌擴增，用質粒小提試劑盒提取重組質粒，0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，重組質粒命名為pGM-T-Luffin-a，采用菌落PCR 和雙酶切鑒定，再用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。將重組質粒pGM-T-Luffin-a 和原核表達載體pET-15b（+）分別進行NdeⅠ、BamHⅠ雙酶切，20 μL 反應體系（NdeⅠ 1 μL、BamHⅠ 1 μL、10×buffer TangoTM2 μL、 質粒 DNA 1 μg、nuclease-free water 補足 20 μL體積），37℃反應過夜，瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收目的DNA條帶，T4DNA 連接酶定向連接Luffin-a 和pET-15b（+），16℃反應過夜，重組質粒命名為 pET-15b（+）-Luffin-a；將連接產(chǎn)物轉化 BL21（DE3）pLys 感受態(tài)細胞，涂 LB（ampr）平板，挑取單克隆菌劃線培養(yǎng)，進行菌落PCR 鑒定；將正確的重組子進一步接種于含50 μg/mL 氨芐霉素的LB 培養(yǎng)液中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜，少量提取質粒，進行酶切鑒定和測序驗證。

1.2.4 Luffin-a的表達及表達產(chǎn)物的檢測 將含有正確表達載體 pET-15b（+）-Luffin-a 的轉化菌 BL21（DE3）pLys接種于20 mL 含相應抗生素的LB 培養(yǎng)液中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜，按1∶100 接種至200 mL 含相應抗生素的新鮮LB培養(yǎng)液中，37℃振蕩培養(yǎng)至OD600為0.6～0.7，留部分菌液做為誘導前對照，剩余部分加IPTG 至濃度為1.0 mmol/L 誘導表達6 h。分別取30 mL 菌液4℃2 000 r/min 離心15 min收集菌體，用PBS 洗滌沉淀2次，加入1 mL 裂解液懸浮沉淀，反復超聲凍融至菌液變清亮，12 000 r/min 離心取上清，100℃煮沸5 min，進行PAGE 電泳檢測。

2 結果

2.1 絲瓜Luffin-a 基因片段的PCR 擴增

Trizol 常規(guī)提取未成熟絲瓜種子總RNA，紫外分光光度儀檢測RNA 樣品A260/A280值為1.83，說明樣品純度好。PCR 擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，EB 染色后在凝膠成像系統(tǒng)中拍照取圖，在760 bp 處有一條強熒光條帶，其大小與預期片段大小一致（圖1）。

圖1 Luffin-a 基因RT-PCR 擴增產(chǎn)物電泳

2.2 Luffin-a 基因重組表達質粒的鑒定

PCR 產(chǎn)物切膠回收，與T 載體連接，連接產(chǎn)物轉化感受態(tài)細胞TOP10，通過藍白斑篩選，提取重組的克隆載體，采用菌落PCR 和雙酶切鑒定，再用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測（圖2）。PCR 擴增產(chǎn)物和原核表達載體PET-15b（+）分別進行NdeⅠ、BamHⅠ雙酶切，T4DNA 連接酶定向連接，16℃反應過夜；重組質粒pET-15b（+）-Luffin-a 轉化 BL21（DE3）pLys 感受態(tài)細胞，涂 LB（ampr）平板，挑取單克隆菌劃線培養(yǎng)，進行菌落PCR 鑒定（圖2）。將正確的重組子接種于含氨芐霉素的LB 培養(yǎng)液中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜，少量提取質粒，進行酶切，用1%瓊脂糖電泳檢測（圖3）。酶切結果顯示，在750 bp 和5 500 bp 附近各有一條帶，說明Luffin-a 已經(jīng)插入表達載體pET-15b（+）。

圖2 重組子的菌落PCR 鑒定

圖3 Pet-15b（+）-Luffin-a 重組子的酶切結果

2.3 Luffin-a的誘導表達

將重組表達質粒pET-15b（+）-Luffin-a 轉化表達感受態(tài)BL21（DE3）pLys 菌株，在含相應抗生素的LB 液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，經(jīng)IPTG 誘導6 h，在菌液以及超聲上清和沉淀中均可見約27 kD的蛋白被誘導表達，與預期結果相符。不含重組表達質粒的空載體工程菌經(jīng)誘導后沒有出現(xiàn)這一條帶（圖4）。從而說明重組表達質粒pET-15b（+）-Luffin-a 在這一宿主菌中可表達絲瓜核糖體失活蛋白RIP。

圖4 陽性重組子誘導表達

3 討論

RIPs是一類毒蛋白，其主要酶學性質是具有RNA N-糖苷酶活力，更確切地說是多聚核苷酸∶腺苷糖苷酶活力，可特異地修飾核糖體大亞基rRNA 3'-端莖環(huán)結構的腺嘌呤殘基而導致核糖體失活，阻止多肽鏈的延伸，從而抑制靶細胞中蛋白質合成。RIPs 不影響自身28s rRNA，但對親緣關系較遠生物的核糖體表現(xiàn)不同程度的損傷。核糖體失活蛋白主要存在于植物當中，特別是苦瓜、絲瓜等葫蘆科植物的果實和種子中有多種核糖體失活蛋白。根據(jù)RIPs的物理特性可將其分為3 類：1型、2型和3型， 目前分離到的Luffin-a[1]、Luffin-b[4]及新型小分子蛋白 Luffin-s[8]、Luffin-P1[7，9]均屬Ⅰ型RIP。作為非病原性的一類毒蛋白基因，用做抗病毒的轉基因材料，Luffin 具有一定的應用前景。對絲瓜核糖體失活蛋白的研究報道較少，最先發(fā)現(xiàn)絲瓜種子中毒蛋白的是Kishida等[10]，他們將其命名為Luffin。1988年研究者從絲瓜籽中分離到兩種單鏈核糖體失活蛋白Luffin-a 和 Luffin-b。在1990年和1992年相繼報道Luffin-a的氨基酸序列和cDNA 序列。研究發(fā)現(xiàn)，絲瓜種類不同，從其種子中提取的核糖體失活蛋白的氨基酸序列也有不同，其毒性也不同[1]。目前對絲瓜核糖體失活蛋白的體外研究很少，Au等[11]發(fā)現(xiàn)luffin 能有效抑制HIV-1 整合酶的活性。有研究發(fā)現(xiàn)，RIPs 能抑制人類腫瘤細胞，同時又不殺死或很少殺死正常細胞[4-5]。

總之，絲瓜RIP 有廣泛的應用前景，但仍有許多問題有待解決，如各種luffin的同源性，小分子量luffin是完全的新物質，或是某些大分子luffin的剪切產(chǎn)物，還是某一基因不同時期的表達產(chǎn)物；幾種luffin的活性位點是否相同等。本研究根據(jù)報道的Luffin-a[2]核酸序列，構建其原核表達載體，體外誘導表達絲瓜核糖體失活蛋白，為進一步研究luffin的酶學性質及其抗病毒、抑制腫瘤、誘導細胞凋亡等方面的生物學活性奠定基礎。

[1]Yeung H，Li W，Ng T.Isolation of a ribosome-nactivating and abortifacient protein from seeds of Luff a acutangula[J].International Journal of Peptide and Protein Research，2009，38（1）：15-19.

[2]Liu L，Wang R，He W，et al.Cloning and soluble expression of mature α-luffin from Luffa cylindrica and its antitumor activities in vitro[J].Acta biochimica et biophysica Sinica，2010，42（8）：585-592.

[3]Cui P，Yu M，Luo Z，et al.Intracellular signaling pathways involved in cell growth inhibition of human umbilical vein endothelial cells by melatonin[J].J Pineal Res，2008，44（1）：107-114.

[4]Ng TB，Lam JSY，Wong JH，et al.Differential abilities of the mushroom ribosome-inactivating proteins hypsin and velutin to perturb normal development of cultured mouse embryos[J].Toxicology in vitro，2010，24（4）：1250-1257.

[5]Ng YM，Yang Y，Sze KH，et al.Structural characterization and anti-HIV-1 activities of arginine/glutamate-rich polypeptide Luffin P1 from the seeds of sponge gourd （Luffa cylindrica） [J].Journal of Structural Biology，2011，174（1）：164-172.

[6]Wu H，Lu Q，Gao W，et al.Construction and expression of prokaryotic expression vector for recombinant immunotoxin EBI3-Luffin P1 and biological activity of expressed product[J].Chinese Journal of Biologicals，2012，3：17.

[7]Li F，Yang X，Xia H，et al.Purification and characterization of Luffin P1，aribosome-inactivatingpeptidefromtheseedsof Luffa cylindrica[J].Peptides，2003，24（6）：799-805.

[8]Wang R，Gan C，Gao W，et al.A novel recombinant immunotoxin with the smallest ribosome-inactivating protein Luffin P1：T-cell cytotoxicity and prolongation of allograft survival[J].Journal of Cellular and Molecular Medicine，2010，14（3）：578-586.

[9]劉樹雷，何威，王儒鵬，等.Luffin P1-KDEL的構建、表達、純化及鑒定[J].免疫學雜志，2010，（1）：16-20.

[10]Kishida K，Masuho Y，Hara T.Protein-synthesis inhibitory protein from seeds of Luffa cylindria roem[J].FEBS Letters，1983，153（1）：209-212.

[11]Au TK，Collins R，Lam T，et al.The plant ribosome inactivating proteins luffin and saporin are potent inhibitors of HIV-1 integrase[J].FEBS Letters，2000，471（2）：169-172.