羅順祥 徐尚華 張 虹 鐘文亮 吳艷晴

1.福建醫(yī)科大學(xué)附屬南平市第一醫(yī)院心內(nèi)科一區(qū)，福建南平 353000；2.福建醫(yī)科大學(xué)附屬南平市第一醫(yī)院骨科一區(qū)，福建南平 353000

糖尿病血管病變是嚴重影響糖尿病患者生命質(zhì)量及致死、致殘的主要原因。但臨床上發(fā)現(xiàn)糖尿病患者冠心病的發(fā)生與血糖水平并不相關(guān)，英國前瞻性糖尿病研究（UKPDS）亦證明單純血糖控制并不能達到減少糖尿病大血管合并癥的目的。高血糖引起的氧化應(yīng)激是糖尿病動脈粥樣硬化發(fā)生的主要原因，抗氧化可延緩動脈粥樣硬化的發(fā)生。血紅素氧化酶-1（HO-1）是細胞保護蛋白，它分解血紅素產(chǎn)生的一氧化碳（CO）、游離鐵和膽紅素，具有抗氧化、抗炎作用，可保護血管免受氧化應(yīng)激及炎癥介質(zhì)的損傷[1]。HO-1 基因啟動子區(qū)內(nèi)包含著一個由GT 二核苷酸重復(fù)組成的（GT）n 短串聯(lián)重復(fù)序列（STR）多態(tài)性，人 HO-1 基因啟動區(qū)所特有微衛(wèi)星結(jié)構(gòu)的 （GT）n 長度直接影響HO-1基因的轉(zhuǎn)錄水平，HO-1 啟動子區(qū)GT 短重復(fù)序列人體內(nèi)的HO-1 表達水平更高[2]。本課題探討2型糖尿病（T2DM）患者HO-1 基因多態(tài)性、單核細胞中HO-1 的表達水平，評價HO-1 基因多態(tài)性及HO-1 表達水平與冠心病的相關(guān)性，為進一步研究如何調(diào)節(jié)HO-1 的表達，從而應(yīng)用于臨床治療提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

2008年6月～2011年10月，選擇在福建醫(yī)科大學(xué)附屬南平市第一醫(yī)院住院經(jīng)冠狀動脈造影證實合并有冠心病的糖尿病患者62例作為冠心病組，其中，急性心肌梗死2例，陳舊性心肌梗死5例，不穩(wěn)定型心絞痛20例，穩(wěn)定型心絞痛35例；另選擇性別、年齡與冠心病組相仿，經(jīng)冠脈造影證實無冠脈明顯狹窄的單純糖尿病患者59例作為對照組。其中，冠心病組62例，男35例，女27例，平均年齡（62.0±3.2）歲，合并高血壓 30例、吸煙 17例；對照組 59例，男 31例，女28例，平均年齡（63.0±2.9）歲，合并高血壓36例、吸煙18例。兩組年齡、性別、吸煙、體重指數(shù)（BMI）、血壓、空腹血糖（FPG）、餐后 2 h 時血糖（2 h PG）、糖化血紅蛋白（HbA1c）、總膽固醇（TC）及低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）水平比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P>0.05），具有可比性。見表1。

1.2 方法

1.2.1 體檢和生化檢查 所有患者入院后測量身高、體重、腰圍、臀圍和血壓，計算BMI。禁食10 h 后采空腹靜脈血，測定血常規(guī)、TC、LDL-C、FPG、HbA1c及 2 h PG。

1.2.2 冠狀動脈造影檢查 利用飛利浦公司DSA，采用經(jīng)橈動脈或股動脈穿刺法進行冠狀動脈造影，對每支血管進行最佳的多體位造影，以直徑狹窄百分數(shù)對其進行評估。有一條主要冠狀動脈直徑狹窄百分數(shù)>50%診斷為冠心病，冠狀動脈直徑狹窄百分數(shù)<20%為正常。

表1 冠心病組和對照組基本資料比較（±s）

表1 冠心病組和對照組基本資料比較（±s）

注：1 mm Hg=0.133 kPa

組別例數(shù) 性別（男/女，例）年齡（歲）吸煙[n（%）]體重指數(shù)（kg/m2）收縮壓（mm Hg）舒張壓（mm Hg）空腹血糖（mmoL/L）餐后2 h 血糖（mmoL/L）糖化血紅蛋白（%）總膽固醇（mmoL/L）低密度脂蛋白膽固醇（mmoL/L）冠心病組對照組62 59 35/27 31/28 62.0±3.2 64.0±2.9 17（27.4）18（30.5）24.6±3.7 23.7±3.5 138.5±24.5 132.8±23.1 81.6±18.4 82.3±16.5 6.7±1.3 7.1±1.0 10.4±1.8 9.8±1.6 6.7±1.6 7.0±1.4 5.20±1.04 4.95±0.73 3.56±0.49 3.29±0.57

1.2.3 HO-1 啟動子區(qū) （GT）n 檢測及分型 采用熒光標記PCR 以及毛細管電泳相結(jié)合技術(shù)進行基因分型。取研究對象外周抗凝血5 mL，分離淋巴細胞和單核細胞。分離單個核細胞后，采用QIAGEN 試劑盒提取細胞基因組DNA。primer5.0軟件設(shè)計擴增啟動子區(qū)引物。引物序列如下：正向 ：5'-GGATTCCAGCAGGTGACATT-3'；反 向 ：5'-ACAGCTGATGCCCACTT TCT-3'。25 ML 體系PCR 擴增，PCR 擴增條件：94℃預(yù)變性 5 min，94℃變性 30 s，55℃退火30 s，72℃延伸 45 s，循環(huán) 35次，最后 72℃延伸 10 min。PCR 產(chǎn)物純化后采用ABI 公司3730 進行毛細管電泳，run 3730 data collection v2.0 收集毛細管電泳熒光信號，GeneMapper Software v3.5軟件對峰圖進行分型（重復(fù)次數(shù)），確定（GT）n多態(tài)性的多態(tài)。（GT）重復(fù)次數(shù)＜27，為 S 等位基因，（GT）重復(fù)次數(shù)≥27，為 L 等位基因，分別構(gòu)成 SS、SL、LL 這3種基因型[3]。

1.2.4 Western blot 測HO-1 的表達 應(yīng)用單去污劑裂解液提取單個核細胞蛋白質(zhì)，利用BCA 法測定蛋白含量，以每孔50 μg 蛋白量加樣，穩(wěn)壓125 V 在10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，再進行蛋白質(zhì)的電轉(zhuǎn)移（轉(zhuǎn)移槽50 V 轉(zhuǎn)膜1 h）。5%脫脂奶粉4℃封閉過夜。將膜分別與一抗、二抗反應(yīng)（HO-1 一抗稀釋度 1∶500，β-actin 一抗稀釋度 1∶1000，二抗稀釋度1∶500，室溫下反應(yīng)2 h）。免疫反應(yīng)后將膜蓋于發(fā)光試劑（北京中杉試劑公司）上反應(yīng)1 min，暗室曝光3～5 min，X線片經(jīng)顯影、定影后待檢。結(jié)果掃描進計算機，用Image-Pro-Plus 自動圖像分析軟件（Version：4.5）對HO-1 光帶進行分析，以HO-1 蛋白帶的灰度峰值代表HO-1 的表達量[4]。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 13.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，計數(shù)資料比較采用χ2檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 冠心病組與對照組（GT）n 重復(fù)序列的多態(tài)分布

在研究人群中，HO-1 基因的啟動子區(qū) （GT）n 呈高度多態(tài)性，（GT）n 重復(fù)次數(shù)為14～39次，在所有研究對象及兩組內(nèi)均呈雙峰分布，23次和30次頻率最高，（GT）n 重復(fù)次數(shù)在各組中的分布頻數(shù)見圖1。按文獻[3]報道，將HO-1基因的啟動子區(qū) （GT）n多態(tài)性分為2個等位基因：GT 重復(fù)次數(shù)＜27次為短重復(fù)序列（S 等位基因），GT 重復(fù)次數(shù)≥27次為長重復(fù)序列（L 等位基因）。冠心病組的短重復(fù)序列（S 等位基因）明顯少于對照組（P＜0.01）。所有患者因此分為攜帶SS、SL、LL 基因型3種。冠心病組HO-1 基因啟動子區(qū) （GT）n 重復(fù)序列基因型分布為：SS型15例，SL型16例，LL型31例；對照組分別為SS型26例，SL型16例，LL型17例，兩組基因型分布存在明顯差異，冠心病組短重復(fù)序列SS型明顯少于對照組（P＜0.05）。見表2。

表2 兩組等位基因及基因型的分布（例）

圖1 （GT）n重復(fù)次數(shù)在兩組的頻數(shù)分布

2.2 Western blot 測HO-1 蛋白表達水平

冠心病組患者HO-1 蛋白表達明顯低于對照組，分別為（10.5±1.6）、（15.6±2.2），差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜ 0.01）。見表3。

表3 兩組血紅素氧化酶-1蛋白表達水平比較

3 討論

HO-1 是一種誘導(dǎo)性細胞保護酶，它分解血紅素產(chǎn)生的CO、游離鐵和膽紅素，具有抗氧化、抗炎作用，可保護血管免受氧化應(yīng)激及炎癥介質(zhì)的損傷[1]。HO-1 基因啟動子內(nèi)存在GT 雙核苷酸重復(fù)序列，其5′端區(qū)域（GT）n 重復(fù)序列具有高度多態(tài)性，（GT）n 重復(fù)次數(shù)對HO-1 的基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生不同的調(diào)節(jié)作用。依照重復(fù)次數(shù)分為S型（n＜27）和L型（n≥27），從而產(chǎn)生 SS、SL、LL 3種基因型。已有的研究發(fā)現(xiàn)HO-1 基因多態(tài)性與冠狀動脈斑塊負荷相關(guān)，具有L 基因型的患者較S 基因型的斑塊負荷明顯加重[5]。而王迎洪等[6]的研究進一步發(fā)現(xiàn)HO-1 基因多態(tài)性與冠心病冠脈病變程度相關(guān)，LL 基因型頻率分布在多支血管病變組較單支和雙支血管病變組高。但目前對于上述研究結(jié)果卻存在爭議，在L üblinghoff 等[7]的研究中發(fā)現(xiàn)HO-1 基因多態(tài)性與冠心病及心肌梗死的發(fā)生并無相關(guān)性。在本研究中發(fā)現(xiàn)，糖尿病患者冠心病組短重復(fù)序列（S 等位基因）明顯少于對照組（P＜0.01），冠心病組基因型主要以LL型和SL型為主，對照組主要以SS型和SL型為主，兩組基因型分布存在明顯差異，冠心病組短重復(fù)序列SS型明顯少于對照組（P＜0.05）。因此本研究認為，在糖尿病人群中，HO-1基因多態(tài)性與冠心病發(fā)病相關(guān)，相對于短重復(fù)序列（S 等位基因）者，長重復(fù)序列（L 等位基因）者為冠心病易感人群。

既往研究表明，短（GT）n 雙核苷酸串聯(lián)重復(fù)序列（n＜27次）使HO-1 表達含量上調(diào)，發(fā)揮抗氧化應(yīng)激、抗炎癥損傷、抗細胞凋亡作用，保護冠狀動脈血管內(nèi)皮細胞[8]。而長串聯(lián)重復(fù)序列導(dǎo)致HO-1 轉(zhuǎn)錄水平下降，對血管內(nèi)皮細胞的保護作用減弱[9]。李瑩等[10]的研究證實在急性冠脈綜合征患者HO-1 表達水平與冠狀動脈病變程度相關(guān)，冠脈病變程度越重其HO-1 表達水平越低。在本研究中，冠心病組與對照組相比其血壓、血脂、血糖及吸煙等均無明顯差異，但冠心病組HO-1 表達水平較對照明顯降低 [（10.5±1.6）和（15.6±2.2）]（P ＜ 0.01）。進一步證實，在糖尿病人群，擁有長重復(fù)序列（L 等位基因）患者，其HO-1 表達水平明顯減低，更易發(fā)生冠心病。

綜上所述，本研究結(jié)果提示，在糖尿病人群中，HO-1的基因多態(tài)性與冠心病易感相關(guān)，擁有長重復(fù)序列（L 等位基因）者HO-1 表達水平較擁有短重復(fù)序列 （S 等位基因）者明顯減低，為冠心病易感人群?；蛐头治隹梢灶A(yù)示個體冠心病易感性，但冠心病為因素交互作用所致，須做到早期綜合防治。

[1]Stocker R，Perrella MA.Heme oxygenase-1：a novel drug target for atherosclerotic diseases[J].Circulation，2006，114（20）：2178-2189.

[2]Chen M，Zhou L，Ding H，et al.Short（GT）n repeats in heme oxygenase-1 gene promoterare associated with lower risk of coronary heart disease in subjects with high levels of oxidative stress[J].Cell Stress Chaperones，2012，17（3）：329-338.

[3]Wu MM，Chiou HY，Lee TC，et al.GT-repeat polymorphism in the heme oxygenase-1 gene promoter and the risk of carotid atherosclerosis related to arsenic exposure[J].J Biomed Sci，2010，17：70.

[4]張國紅，陳宋明.冠心病患者缺氧誘導(dǎo)因子-1α與血紅素氧化酶-1的相關(guān)性研究[J].中國全科醫(yī)學(xué)，2011，14（15）：1662-1664.

[5]Kr ál A，Kov árn ík T，Kr ál ík L，et al.Genetic variants in haem oxygenase-1andendothelialnitricoxidesynthaseinfluencetheextentandevolution of coronary artery atherosclerosis[J].Folia Biol（Praha），2011，57（5）：182-190.

[6]王迎洪，馬依彤，付真彥，等.血紅素加氧酶1 基因啟動子區(qū)多態(tài)性與冠心病的相關(guān)性及其對血清膽紅素水平的影響[J].中國動脈硬化雜志，2008，16（10）：834-837.

[7]L üblinghoffN，Winkler K，Winkelmann BR，et al.Genetic variants of the promoter of the heme oxygenase-1 gene and their influence on cardiovascular disease（The Ludwigshafen Risk and Cardiovascular Health Study） [J].BMC Med Genet，2009，10：36.

[8]Maruhashi K，Kasahara Y，Ohta K，et al.Paradoxical enhancement of oxidative cell injury by overexpression of heme oxygenase-1 in an anchorage-dependent cell ECV304[J].J Cell Biochem，2004，93（3）：552-562.

[9]Brydun A，Watari Y，Yamamoto Y，et al.Reduced expression of heme oxygenase-1inpatientswithcoronaryatherosclerosis[J].Hypertens Res，2007，30（4）：341-348.

[10]李瑩，宋耀明，趙友光，等.急性冠脈綜合征患者血清APN、HO-1水平與冠狀動脈病變嚴重程度的相關(guān)性研究[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2011，33（8）：845-848.