苗伏龍 劉 鵬 魏 明 張立軍 于則利

1.河北醫(yī)科大學第一醫(yī)院肝膽外科，河北石家莊 050031；2.河北醫(yī)科大學第一醫(yī)院普外科，河北石家莊 050031；3.首都醫(yī)科大學附屬北京同仁醫(yī)院普外科，北京 100730

近幾十年來，肝細胞的實驗和臨床應用研究已經(jīng)取得了卓越成就，尤其是在生物人工肝和肝細胞移植等方面，為肝臟疾病的治療展現(xiàn)了誘人的前景[1-6]。隨著對肝細胞需求的不斷增加，尋找可以長期有效保存肝細胞的方法就迫在眉睫。此外，目前已有的研究表明合適的肝臟缺血預處理 （ischemic preconditioning，IPC）可以為肝臟缺血再灌注損傷提供有效的保護[7-19]。該實驗正是利用缺血預處理對肝臟產(chǎn)生的這種保護機制，通過對不同時間缺血預處理的兔肝細胞存活率及功能情況的檢測，探討對兔肝臟進行適當時間的缺血預處理是否可以提高分離后肝細胞低溫保存的效果，從而推動其在臨床實踐中的應用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物與分組 軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心提供純種雄性新西蘭大白兔40只，3月齡，體重2～2.5 kg，隨機分為 4 組：未預處理組（NPC），5 min 缺血預處理組（IPC5），10 min 缺血預處理組（IPC10），15 min缺血預處理組（IPC15）。

1.1.2 主要試劑儀器 電熱恒溫水浴箱為上海醫(yī)用恒溫設備廠生產(chǎn)，高速低溫臺式離心機為德國Eppendorf公司生產(chǎn)，4℃冰箱及-20℃冰箱為中國海爾生產(chǎn)，-80℃冰箱為日本 SANYO生產(chǎn)，Beckman SYNCHRON CX4CE型全自動生化分析儀為美國Beckman公司生產(chǎn)，Ⅳ型膠原酶、Hanks液、D-hanks液和臺盼藍購于美國Sigma公司，RPMI-1640培養(yǎng)液和胎牛血清購于美國Hyclone公司，二甲基亞砜（DMSO）購于德國Appliche公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 缺血預處理 術前禁食 12 h，20%烏拉坦以5 mL/kg耳緣靜脈注射麻醉動物，腹部皮膚褪毛，常規(guī)消毒鋪巾，腹正中切口進入腹腔，暴露并游離肝臟，分離出下腔靜脈、門靜脈和肝動脈，NPC組不行特殊處理；IPC5組為無損傷血管夾夾閉肝血供5 min，再復流5 min；IPC10組為無損傷血管夾夾閉肝血供10 min，再復流10 min；IPC15組為無損傷血管夾夾閉肝血供15 min，再復流 15 min。

1.2.2 分離肝細胞 采用改良Seglen二步膠原酶灌注法分離肝細胞[20]，收集的肝細胞，加入含20%胎牛血清的PRMI-1640液制成懸液，細胞濃度為4×105/mL。

1.2.3 肝細胞的低溫保存 將新制備的細胞懸液移入凍存液 （為含 15%DMSO、20%胎牛血清的 PRMI1640培養(yǎng)液）中，終濃度配制成 4×106/mL，然后移入2 mL的凍存管中，各組分別制備30個樣本。將樣本放置4℃冰箱中30 min→-20℃冰箱中放置1 h→-80℃冰箱中放置4 h→然后快速放于-196℃液氮中保存。

1.2.4 復蘇 各組分別于 2、3、4周后取出樣本 10個，立即置于37℃水浴箱內(nèi)解凍復蘇。1000 r/min離心5 min，離心3次，棄去上清液，加入RPMI1640培養(yǎng)液，重新混懸，濃度為 4×105/mL。

1.2.5 指標檢測 將上述凍存前及復蘇后的肝細胞懸液分別取樣，用錐蟲藍拒染法測定細胞存活率。將各組肝細胞于復溫后各時段分別取樣進行培養(yǎng)，并于培養(yǎng)24 h后分別取細胞上清液，檢測谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用統(tǒng)計軟件SPSS 13.0對數(shù)據(jù)進行分析，正態(tài)分布計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組凍存前肝細胞存活率比較

各組分離肝細胞經(jīng)過錐蟲藍拒染法檢測，肝細胞存活率差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 各組凍存前肝細胞存活率比較（%，±s）

表1 各組凍存前肝細胞存活率比較（%，±s）

注：NPC組：未預處理組；IPC5組：5 min缺血預處理組；IPC10組：10 min缺血預處理組；IPC15組：15 min缺血預處理組

組別 只數(shù) 存活率NPC組IPC5組IPC10組IPC15組10 10 10 10 85.21±2.82 86.16±3.07 84.76±1.98 85.18±2.68

2.2 各組不同時段冷凍復溫后肝細胞存活率比較

用錐蟲藍拒染法測定各時段冷凍復溫后肝細胞存活率結(jié)果為：①2周時各組比較差異有統(tǒng)計學意義（P=0.00 ＜ 0.05）。 兩兩比較后發(fā)現(xiàn)，IPC5組與 IPC10組比較差異無統(tǒng)計學意義 （P=0.51 ＞ 0.05），IPC5組≈IPC10組＞NPC組＞IPC15組。②3周時各組比較差異有統(tǒng)計學意義（P=0.00 ＜ 0.05）。 兩兩比較后發(fā)現(xiàn)，IPC5組與IPC10組比較差異無統(tǒng)計學意義（P=0.08＞0.05），IPC5組≈IPC10組＞NPC 組＞IPC15組。③4 周時各組比較差異有統(tǒng)計學意義（P=0.00 ＜ 0.05）。 兩兩比較后發(fā)現(xiàn)，IPC5組與IPC10組比較差異無統(tǒng)計學意義（P=0.16 ＞ 0.05），IPC5 組≈IPC10組 ＞NPC 組＞IPC15組。此外，還可發(fā)現(xiàn)同組不同時段復蘇的肝細胞存活率差異均無統(tǒng)計學意義 （P=0.17、0.20、0.17、0.50）。見表2。

表2 各組不同時段冷凍復溫后肝細胞存活率比較（%，±s）

表2 各組不同時段冷凍復溫后肝細胞存活率比較（%，±s）

注：NPC組：未預處理組；IPC5組：5 min缺血預處理組；IPC10組：10 min缺血預處理組；IPC15組：15 min缺血預處理組

組別 只數(shù) 2周 3周 4周NPC組IPC5組IPC10組IPC15組P值10 10 10 10 59.37±1.09 76.81±1.88 76.34±2.01 47.29±1.12＜ 0.05 58.94±1.18 76.66±1.63 75.56±1.40 47.12±1.23＜ 0.05 58.41±1.04 75.64±1.01 74.84±1.62 46.70±1.15＜ 0.05

2.3 各組ALT檢測比較

各組不同時間冷凍復溫后分別取樣進行培養(yǎng)，并于培養(yǎng)24 h后分別取細胞上清液，檢測ALT。結(jié)果為：①2周時各組比較差異有統(tǒng)計學意義（P=0.00＜0.05）。 兩兩比較后發(fā)現(xiàn)，IPC5組與 IPC10組比較差異無統(tǒng)計學意義 （P=0.21 ＞ 0.05），IPC5組=IPC10組＜NPC組＜IPC15組。②3周時各組比較差異有統(tǒng)計學意義 （P=0.00 ＜ 0.05）。 兩兩比較后發(fā)現(xiàn)，IPC5組與IPC10組比較差異無統(tǒng)計學意義 （P=0.06 ＞ 0.05），IPC5組≈IPC10組＜NPC組＜IPC15組。③4周時各組比較差異有統(tǒng)計學意義（P=0.00 ＜ 0.05）。 兩兩比較后發(fā)現(xiàn)，IPC5組與IPC10組比較差異無統(tǒng)計學意義 （P=0.053 ＞ 0.05），IPC5組≈IPC10組＜NPC 組＜IPC15組。 此外，還可發(fā)現(xiàn)同組不同時段復蘇的肝細胞ALT檢測均無差異統(tǒng)計學意義（P=0.80、0.63、0.27、0.60）。 見表 3。

表3 各組不同時段復溫后ALT的檢測（U/L，±s）

表3 各組不同時段復溫后ALT的檢測（U/L，±s）

注：NPC組：未預處理組；IPC5組：5 min缺血預處理組；IPC10組：10 min缺血預處理組；IPC15組：15 min缺血預處理組；ALT：谷丙轉(zhuǎn)氨酶

NPC組IPC5組IPC10組IPC15組10 10 10 10 22.39±0.98 12.21±1.17 12.78±1.03 36.79±0.81 22.70±1.02 12.56±0.97 13.45±1.10 37.01±0.95 22.59±1.08 12.63±0.95 13.55±1.20 37.18±0.85組別 只數(shù) 2周 3周 4周

3 討論

自1986年Murry等[21]在對心肌組織的研究中發(fā)現(xiàn)缺血預處理效應以來，對于各種組織器官的缺血預處理的相關研究就在不斷的進行中，到目前為止已取得了許多重要成果，但仍然存在許多尚未解決的難題，其中之一就是對于不同的器官如何選擇合適的預處理時間，從而對器官達到最佳的保護作用以及如何將這一保護作用運用到其它相關的研究中。

缺血預處理的保護作用在多種器官中都普遍存在，其具體機制尚未完全明確。不同的研究器官采用的缺血預處理的時間不同，比如Murry等[21]在研究狗的心肌IRI中使用的是5 min阻斷，5 min開放的預處理方式，而Clavien等[22]開展的臨床研究中采用的方式是10 min阻斷，10 min開放的預處理方式等等。腦的預處理方式一般為1～2 min，心肌試驗多采用3～5 min，骨骼肌一般為5 min[9]。不同的試驗者研究的結(jié)果可能不同，比如對于肝組織，Yadav等[7]曾對照研究了15 min預處理方式，結(jié)果顯示與5 min的處理方式無明顯區(qū)別。而其他研究則顯示[9，23]，5 min預處理與15 min預處理是有差異的。

目前深低溫保存是肝細胞長期保存的主要方法[5-6，24-26]，影響其凍存效果的因素有很多，比如：凍存保護劑的選擇、凍存劑的濃度、細胞的濃度、降溫和復溫方法等等。正是基于上述已知的凍存肝細胞較為適宜的因素基礎上進行的本次實驗，結(jié)果顯示了對于兔肝臟進行不同時間的缺血預處理后分離保存，5 min組和10 min組可以增強肝細胞的凍存效果，兩者無統(tǒng)計學差異，而15 min組不但沒起到保護作用反而增加了肝細胞的破壞。

本實驗初步探討了不同時間缺血預處理對于兔肝細胞深低溫保存的影響，得出了上述結(jié)論，但是，實驗結(jié)果受研究條件、方法和實驗對象等多因素的影響，可能會造成結(jié)果出現(xiàn)一定的差異。此外，本實驗尚存有一些亟待解決的難題和值得探討的方面：①缺血預處理的機制。②最佳缺血處理的時間。③不同時間缺血預處理保護作用在不同的種屬之間可能有差異。④不同方式缺血預處理的比較，等等。因此今后仍需繼續(xù)進行該課題的相關研究，進一步探討缺血預處理的臨床應用價值。

[1]Jorns C，Ellis EC，Nowak G，et al.Hepatocyte transplantation for inherited metabolic diseases of the liver[J].Intern Med，2011，272（3）：201-223 .

[2]Ken H，Takeshi A，Zhenghao J，et al.Hepatocyte Transplantation from Steatotic Liver in a Rat Model [J].Surg Res，2007，142（1）：104-112.

[3]Dianat N，Steichen C，Vallier L，et al.Human pluripotent stem cells for modelling human liver diseases and cell therapy[J].Curr Gene Ther，2013，13（2）：120-132.

[4]Dhawan A，Strom SC，Sokal E，et al.Human hepatocyte transplantation[J].Methods Mol Biol，2010，640：525-534.

[5]Terry C，Dhawan A，Mitry RR，et al.Cryopreservation of isolated human hepatocytes for transplantation：State of the art[J].Cryobiology，2006，53（2）：149-159.

[6]Lee JH，Park JH，Park HJ，et al.Cryopreservation of immobilized rat hepatocytes for the development of a bioartificial liver system[J].Transplant Proc，2012，44（4）：1005-1008.

[7]Yadav SS，Sindram D，Perry DK，et al.Ischemic precondition protects the mouse liver by inhibition of apoptosis through a caspaspe-dependent path-way[J].Hepatology，1999，30：1223-1231.

[8]秦嵩，孫備，許軍，等.缺血預處理對大鼠肝臟低溫保存的保護作用[J].中國普外基礎與臨床雜志，2003，10（4）：323-327.

[9]關養(yǎng)時，呂新生.不同時間的缺血預處理對肝臟缺血再灌注損傷的影響[J].中華外科雜志，1999，37（11）：700.

[10]Helewski K，Kowalczyk ZG，Czecior E，et al.Protective effect of intermittent clamping of the portal triad in the rat liver on liver ischemia-reperfusion in jury [J].Hepat Mon，2011，11（6）：445-451.

[11]Wang M，Shen J，F(xiàn)eng B，et al.Remote ischemic preconditioning promotes early liver cell proliferation in a rat model of small-for-size liver transplantation [J].Surg Res，2013，179（1）：245-253.

[12]Jin LM，Jin SF，Liu YX，et al.Ischemic preconditioning enhances hepatocyte proliferation in the early phase after is-chemia under hemi-hepatectomy in rats [J].Hepatobiliary Pancreat Dis Int，2012，11（5）：521-526.

[13]Montalvo EE，Pina E，Montalvo AC，et al.Urrutia R，role of ischemic preconditioning in liver surgery and hepatic transplantation[J].Gastrointest Surg，2009，13（11）：2074-2083.

[14]梁珊，石 中，聶盛丹.缺血預處理預防肝細胞分離過程中的缺血再灌注損傷[J].中國組織工程研究與臨床康復，2011，15（44）：8293-8296.

[15]李新輝，王淑敏.缺血預處理對鼠肝細胞缺血再灌注損傷的影響[J].臨床合理用藥，2012，5（7A）：41-43.

[16]張翌，蔡遜，潘明新，等.供肝缺血預處理保護作用的實驗研究[J].華南國防醫(yī)學雜志，2011，25（3）：181-190.

[17]Fu JZ，Wang Y，Zhang LJ，et al.Protective effect of liver ischemic preconditioning on rat hepatocytes [J].Sci China C Life Sci，2009，52（9）：836-840.

[18]陳闖，李文美，蔣厚文，等.肝臟及肢體缺血預處理抗大鼠肝缺血再灌注損傷的實驗研究[J].中國普通外科雜志，2010，19（1）：23-27.

[19]Tapuria N，Junnarkar SP，Dutt N，et al.Effect of remote ischemic preconditioning on hepatic microcirculation and function in a rat model of hepatic ischemia reperfusion injury[J].HPB，2009，11（2）：108-117.

[20]Seglen PO.Citation frequency and journal impact:valid indicators of scientific quality? [J].J Intern Med，1991，229（2）：109-111.

[21]Murry CE，Jennings RB，Reimer KA.Preconditioning with ischemia：a delay of lethal cell injuty in ischemec myocardium[J].Circulation，1986，74（5）：1124-1126.

[22]Clavien PA，Yadav S，SindramD，et al.Protective effects of ischemic preconditioning for liver resection performed under inflow occlusion in humans[J].Ann Surg，2000，232（2）：155-162.

[23]Lloris JM，Cejalvo D，Toledo LH，et al.Preconditioning：effect upon lesion modulation in warm liver ischemia[J].Transplant Proc，1993，25（6）：3303-3306.

[24]楊波，周燕，劉寶林，等.肝細胞低溫保存的實驗研究[J].中國生物醫(yī)學工程學報，2011，30（2）：308-311.

[25]馮淵，李德衛(wèi)，楊曉波.原代肝細胞的分離和移植[J].中國組織工程研究，2012，16（18）：3314-3317.

[26]杭化蓮，張磊，施曉雷.成人原代肝細胞的分離、培養(yǎng)及凍存[J].世界華人消化雜志，2011，19（19）：2016-2021.