薛永常，張 燦

(大連工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，遼寧大連 116034)

幾丁質(zhì)是由N-乙酰-D-氨基葡萄糖以β-1，4糖苷鍵連接成的高分子多糖，廣泛存在于甲殼動物和昆蟲的外殼及藻類、真菌類的細(xì)胞壁及高等植物中［1］。幾丁質(zhì)降解獲得的生理活性的幾丁寡糖水溶性好，易于吸收，具有較好的抗真菌、抗癌良好的生物降解性及無毒性等特點，已廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、農(nóng)業(yè)、環(huán)保和保健等領(lǐng)域［2-7］。目前制備幾丁寡糖的方法有物理降解法、化學(xué)降解法、酶解法和合成法［8］。酶解法反應(yīng)條件較溫和，具有不需要加入其他反應(yīng)試劑，不發(fā)生其他副反應(yīng)，產(chǎn)物聚合度適中、高效、節(jié)能、無污染等優(yōu)點，是公認(rèn)的最佳生產(chǎn)工藝。目前制備的幾丁質(zhì)酶活性較低，難以獲得大量的專一性的幾丁質(zhì)酶，使幾丁質(zhì)酶的生產(chǎn)成本過高，不能滿足生產(chǎn)的需要，因此研究高活性幾丁質(zhì)酶是解決幾丁寡糖生產(chǎn)制備的關(guān)鍵［9］。幾丁質(zhì)酶(chitinase)是能催化降解幾丁質(zhì)β-1，4糖苷鍵的一類水解酶，許多微生物都能產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶［9-12］。在海洋環(huán)境中有著大量幾丁質(zhì)，其降解主要通過微生物完成，海洋菌是幾丁質(zhì)酶的重要來源。本文從大連海域的泥樣中篩選出1株能將幾丁質(zhì)轉(zhuǎn)化成多種低聚糖的海洋菌，通過對該菌株進(jìn)行生物學(xué)鑒定為將來更好地認(rèn)識和進(jìn)一步利用它提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 幾丁質(zhì)購于合肥博美生物技術(shù)有限公司;乙酰氨基葡萄糖(NAG)購于阿爾法公司;膠體幾丁質(zhì)自制［13-14］;薄層層析用硅膠G購于青島海洋化工有限公司;細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(溶液型)購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司;瓊脂糖回收試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司。

1.1.2 主要培養(yǎng)基(g/L) ①分離培養(yǎng)基:膠體幾丁質(zhì) 1，K2HPO40.7，KH2PO40.3，蛋白胨 10，MgSO4·7H2O 0.5，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01，ZnSO4·7H2O 0.01，瓊脂 18，陳海水定容至 1 L，調(diào)整至pH 7.0，121 ℃滅菌 20 min;②發(fā)酵培養(yǎng)基:膠體幾丁質(zhì) 1，K2HPO40.7，KH2PO40.3，蛋白胨 10，MgSO4·7H2O 0.5，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01，ZnSO4·7H2O 0.01，蒸餾水定容至 1 L，調(diào)整至 pH 7.0，121℃滅菌20 min;③肉湯培養(yǎng)基:牛肉膏3，蛋白胨10，NaCl 5，pH 7.0，121 ℃滅菌20 min;④LB 培養(yǎng)基:蛋白胨 10，酵母提取物 5，NaCl 10，pH 7.0，121℃滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 篩選產(chǎn)幾丁質(zhì)酶菌株 采用平板稀釋法和透明圈法篩選出產(chǎn)幾丁質(zhì)酶菌株。取大連海域的海泥樣品，加入適量無菌陳海水懸起，上清液涂布于膠體幾丁質(zhì)篩選平板上，28℃培養(yǎng)3～5 d，觀察在菌落周圍是否產(chǎn)生透明圈，挑選透明圈直徑與菌體直徑比較大的菌株作為初篩的產(chǎn)酶菌。

1.2.2 酶催化幾丁質(zhì)降解產(chǎn)物分析 酶反應(yīng)體系:各取發(fā)酵液1 mL，4℃、1 000 r/min離心10 min，取上清 0.5 mL，加入 0.5 mL 1%膠體幾丁質(zhì)(質(zhì)量體積比)，pH 值為7.0的0.2 mmol/L磷酸緩沖液1 mL，50℃下保溫30 min，煮沸10 min，冷卻。產(chǎn)物分析:將酶促反應(yīng)液與含有2～6聚合度的混合幾丁寡糖標(biāo)準(zhǔn)品同時進(jìn)行薄層層析。在薄層層析硅膠板上點樣，展開劑:異丙醇∶V水∶25%氨水 =280∶119∶5.3(體積比)，室溫，上行展開2～3次;顯色劑:二苯胺2 g，苯胺2 mL，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為85%磷酸10 mL溶于100 mL丙酮中，混勻，快速浸泡后85℃烘箱烘烤10 min。

1.2.3 菌株的形態(tài)觀察及生理生化鑒定 用掃描電鏡觀察Z-1菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)，并對菌株進(jìn)行形態(tài)觀察與生理生化鑒定［15］。

1.2.4 細(xì)菌基因組 DNA的提取與16S rDNA PCR擴增 參照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(溶液型)提取Z-1菌基因組DNA為模板，采用16S rDNA通用引物對其進(jìn)行PCR擴增。上游引物為5'-AGAGTTTGATCATGGCTAG-3';下游引物為5'-GTTACCTTGTTACGACTT-3'。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后由上海生工生物工程技術(shù)有限公司測序。

1.2.5 序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建 將測序結(jié)果通過BLAST工具、Clustal X(1.8)軟件進(jìn)行親緣關(guān)系和系統(tǒng)進(jìn)化分析，利用MEGA4.0軟件進(jìn)行分析，并以自展法(bootstrap)進(jìn)行檢測，共循環(huán)1 000次，采用最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹最大樹(Maximum likelihood tree)。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)幾丁質(zhì)酶菌株的篩選與鑒定

利用幾丁質(zhì)分離培養(yǎng)基對初篩獲得菌株進(jìn)行復(fù)篩。接種后于28℃培養(yǎng)，每隔24 h測量1次在篩選平板菌落外圍形成的透明圈直徑(D)及菌落的直徑(d)，根據(jù)透明圈與菌落的直徑比(D/d)，挑選純化3個菌株進(jìn)行酶活測定。菌株的生長形態(tài)如圖1。

圖1 菌體透明圈Fig.1 Transparent rings of strains

將Z-1、Z-2和Z-4等3個菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，初始酶液用DNS法測其酶活，其結(jié)果如表1。從表1可以看出菌株Z-1的初篩與復(fù)篩中透明圈與菌落的大小比最大，酶活較高，故選擇Z-1作為后續(xù)工作的菌種。

表1 菌落篩選及酶活測定情況Table 1 Colony screening and activity determination

通過對Z-1催化膠體幾丁質(zhì)降解的產(chǎn)物進(jìn)行薄層層析分析，其主要產(chǎn)物為聚合度4～5的幾丁寡糖(圖2)，為功能性低聚糖，醫(yī)用保健具較高的應(yīng)用價值，在農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥和食品領(lǐng)域等也具有潛在的開發(fā)和應(yīng)用價值。

圖2 Z-1降解膠體幾丁質(zhì)的薄層色譜分析Fig.2 TLC Analysis of the Degradation of colloidal chitin of Z-1

2.2 Z-1的形態(tài)學(xué)觀察

圖3 電鏡下Z-1菌株的形態(tài)(1 000×)Fig.3 The micrograph of strain Z-1 under scanning electron microscope(1 000×)

通過掃描電鏡觀察，Z-1為革蘭陽性的桿菌形態(tài)(圖3);該菌株在28℃的肉湯培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h后，菌株呈淡黃色凸起的圓形菌落;光滑、濕潤;菌落由白變黃;菌落直徑為2.0～4.0 mm。革蘭陽性菌，產(chǎn)芽胞。Z-1菌株細(xì)胞呈規(guī)則桿狀，(0.6～1.2)μm ×(1.5 ～6.0)μm，不形成菌絲體，無分支，細(xì)胞表面光滑，無鞭毛，不運動。細(xì)胞單個，成鏈或不規(guī)則群狀出現(xiàn)。老培養(yǎng)物有時細(xì)胞變短，但沒有明顯的桿-球周期變化。Z-1生理生化特征見表2。根據(jù)常見細(xì)菌桿菌屬檢索表初步鑒定認(rèn)為該細(xì)菌為芽胞桿菌屬。

表2 Z-1的生化特征Table 2 The biochemical characteristics of strain Z-1

2.3 Z-1的16S rDNA擴增與序列分析

提取Z-1菌株的基因組DNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，作為模板對其16S rDNA進(jìn)行擴增，其擴增結(jié)果如圖4A所示，得到1條大約1.5 kb的清晰單一條帶，條帶整齊無降解。對產(chǎn)物進(jìn)行回收純化如圖4B所示，送上海生工生物工程技術(shù)有限公司測序。

圖4 Z-1菌株擴增的16S rDNA凝膠電泳圖Fig.4 Gel electrophoresis of 16S rDNA of Z-1

2.4 Z-1的16S rDNA序列比對及進(jìn)化樹的建立

Z-1菌株的16S rDNA PCR擴增片段長為1 456 bp。Z-1的16S rDNA序列的BLAST比對結(jié)果顯示，與桿菌屬(Bacillus)的某些種如Bacillus thuringiensis、Bacillus cereus、Bacillus anthracis 的16S rDNA序列同源性最高，可達(dá)到99%。選取10個包括Z-1菌株以及GenBank數(shù)據(jù)庫中與Z-1菌株同源性較高的細(xì)菌構(gòu)建進(jìn)化樹，如圖5所示。

圖5 Z-1菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 The phylogenetic tree of Z-1

由系統(tǒng)發(fā)育分析，在與Z-1菌株具有較高同源性的桿菌屬細(xì)菌中，B.thuring iensis zhu-1(蘇云金芽胞桿菌)和B.cereus Hs1-7(蠟樣芽胞桿菌)與Z-1處于同一個分支，該結(jié)果與序列同源性比較結(jié)果一致，進(jìn)一步表明Z-1菌株可能同屬于芽胞桿菌屬，暫定名為Bacillus sp.Z-1。該菌有可能是海洋環(huán)境的1個新菌株，有待進(jìn)一步驗證。

3 討論

海洋環(huán)境中含有豐富的幾丁質(zhì)［16］，如蝦殼、蟹殼等，這些物質(zhì)如果不經(jīng)過處理，就會造成嚴(yán)重的環(huán)境污染，因此，從海洋環(huán)境中篩選能夠產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶的微生物具有重要的現(xiàn)實意義。本文以膠體幾丁質(zhì)為唯一底物，從大連海域海洋樣品中分離的菌株Z-1，不但能分泌幾丁質(zhì)降解酶，而且能進(jìn)一步酶解將幾丁質(zhì)轉(zhuǎn)化為聚合度4～5的幾丁寡糖的多種多功能性低聚糖，這將極大提高此類低聚糖產(chǎn)品的應(yīng)用價值。對菌株Z-1進(jìn)行了生理生化鑒定及進(jìn)化樹構(gòu)建，表明Z-1為Bacillus屬中的進(jìn)化種群，為進(jìn)一步認(rèn)識和利用Z-1以獲得大量的新型幾丁質(zhì)降解酶制備幾丁寡糖奠定了基礎(chǔ)。

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