祁贊梅，趙國(guó)明，韓 雪，楊 冀，馮 輝，曹雅明

(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，遼寧沈陽 110001)

Tim-1是T細(xì)胞免疫球蛋白域和黏液素樣域(T cell immunoglobulin domain and mucin domain，Tim)基因家族的分子，表達(dá)在T細(xì)胞、B細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞表面，為細(xì)胞活化提供協(xié)同刺激信號(hào)，刺激Th2細(xì)胞增殖和分泌細(xì)胞因子［1-4］。研究發(fā)現(xiàn)，小鼠體內(nèi)分泌IL-10的調(diào)節(jié)性B細(xì)胞(regulatory B cells，Bregs)表面表達(dá)Tim-1，Tim-1結(jié)構(gòu)異常導(dǎo)致Bregs數(shù)量和功能缺陷［5-6］。由于Bregs具有抑制Th1應(yīng)答的作用［7］，可以推Tim-1在免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)中，特別是Th1/Th2應(yīng)答的極化發(fā)揮重要的作用。瘧疾是瘧原蟲通過媒介昆蟲蚊傳播的人類最為嚴(yán)重的寄生原蟲感染性疾病?？汞懕Ｗo(hù)性免疫有賴于Th1和Th2型免疫應(yīng)答的有效建立和協(xié)調(diào)過渡［8-9］。在約氏瘧原蟲P.y17XL感染模型中發(fā)現(xiàn)，BALB/c小鼠原蟲血癥難以控制并最終導(dǎo)致死亡與Th1應(yīng)答難以建立和血漿高水平IL-10有關(guān)［10］。由于Tim-1具有調(diào)節(jié)Th應(yīng)答和維持Bregs功能的作用，本研究觀察了P.y17XL易感和抵抗小鼠中，Tim-1分子表達(dá)與Th應(yīng)答及感染結(jié)局的關(guān)系，旨在為瘧疾免疫應(yīng)答調(diào)控提供新靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及瘧原蟲 DBA2和 BALB/c小鼠，6～8周齡，購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司;約氏瘧原蟲P.yoelii 17XL(P.y17XL)由日本愛媛大學(xué)分子寄生蟲學(xué)教研室贈(zèng)予曹雅明教授。

1.1.2 主要試劑 抗-CD4-APC(GK 1.5)、抗-CD19-PE/Cy5(6D5)、抗-Tim-1-PE(RMT1-4)、TruStain fcX抗-CD16/CD32(93)及同種型對(duì)照均購(gòu)自美國(guó)BioLegend公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒Prime-Script RT Reagent Kit和實(shí)時(shí)定量 PCR試劑盒SYBR Premix Ex Taq II購(gòu)自大連寶生物公司。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物感染 取1× 106P.y17XL寄生的紅細(xì)胞(pRBC)經(jīng)腹腔感染小鼠，自感染后3 d經(jīng)尾靜脈采血，制備薄血膜，Giemsa染色，顯微鏡檢計(jì)數(shù)紅細(xì)胞感染率。

1.2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)與分析 在感染后第1、3、5天處死小鼠，無菌取出脾臟，常規(guī)方法制備脾細(xì)胞懸液，用0.17 mol/L氯化銨裂解紅細(xì)胞。以含10%胎牛血清(FCS)的RPMI 1640調(diào)整脾細(xì)胞終濃度為1×107/mL。取0.1 mL脾細(xì)胞懸液，加入 TruStain fcX(抗-CD16/CD32)封閉抗體1 μg，于冰上孵育15 min。按廠商推薦劑量加入抗-CD4-APC、抗-CD19-PE/Cy5、抗-Tim-1-PE 單克隆抗體或相應(yīng)熒光標(biāo)記同種型抗體，于冰上避光孵育30 min。用含0.2%牛血清白蛋白(BSA)的PBS洗滌1次，重懸于含1%多聚甲醛和0.2%BSA的PBS中。于次日進(jìn)行流式細(xì)胞儀(FACAriaⅡ，美國(guó)B＆D公司)檢測(cè)，每個(gè)樣品獲取10 000～50 000個(gè)細(xì)胞。采用WinMDI 2.9軟件分析數(shù)據(jù)，以同種型對(duì)照為參考確定陰陽性細(xì)胞界限，結(jié)果以二維點(diǎn)陣圖顯示。

1.2.3 實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)細(xì)胞因子mRNA水平 在感染后第1、3、5天處死小鼠，取少量脾組織，使用Trizol試劑提取總 RNA，按 Prime-Script RT Reagent Kit說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。取100 ng RNA的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，按SYBR Premix Ex Ta試劑盒說明書配制20 μL PCR體系，于Corbett Rotor-Gene 6000(Corbett Life Science，Australia)實(shí)時(shí)定量PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增。熱循環(huán)過程:95℃預(yù)變性30 s;95℃ 5 s，60℃ 30 s，45個(gè)循環(huán)。使用核糖體S17蛋白(RPS17)作為內(nèi)參，利用兩倍系列稀釋樣品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。使用的特異性引物序列如下:RPS17 F:5'-TGTCGGGATCCACCTCAA TG-3';RPS17 R:5'-CGCCATTATCCCCAGCAAG-3';IFN-γ F:5'-AAAGACAATCAGGCCATCAG-3';IFN-γ R:5'-TGGGTTGTTGACCTCAAACT-3';IL-10 F:5'-CAGTACAGCCGGGAAGACA-3';IL-10 R:5'-GCATTAAGGAGTCGGTTAGCA-3';Tim-1 F:5'-TGTTGAGAGTGACAGTGGTCT-3';Tim-1 R:5'-GCCTTGTAGTTGTGGGTCTT-3'。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件，Student's t-test比較分析組內(nèi)和組間均值的顯著性差異。P﹤0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 P.y17XL感染的BALB/c和DBA2小鼠原蟲血癥水平和生存率比較

如圖1所示，BALB/c小鼠感染P.y17XL后，外周血紅細(xì)胞感染率迅速上升，在感染后6 d達(dá)到80%左右，導(dǎo)致8只小鼠在感染后6～7 d全部死亡，而DBA2小鼠的原蟲血癥一直維持較低水平，不超過10%，8只小鼠中只有1只在感染后6 d死亡，其余小鼠在感染后10 d仍然存活，2種小鼠生存率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P﹤0.05)。

2.2 P.y17XL感染的BALB/c和DBA2小鼠脾中IFN-γ和IL-10水平的比較

BALB/c小鼠感染P.y17XL后，脾組織中Th1型細(xì)胞因子IFN-γ mRNA水平上升較慢，在感染后第5天僅為未感染小鼠IFN-γ mRNA水平的20倍，而對(duì)P.y17XL抵抗的DBA2小鼠在感染后3 d脾IFN-γ mRNA水平就接近正常小鼠的20倍;感染后第3、5天BALB/c小鼠脾 IFN-γ mRNA水平均顯著低于DBA2小鼠，P﹤0.05。同時(shí)，BALB/c小鼠脾組織中Th2型細(xì)胞因子IL-10 mRNA水平在感染P.y17XL后迅速上升，在感染后第3天和第5天分別為正常小鼠90和200余倍，均顯著高于DBA2小鼠(P﹤0.05和P﹤0.01)。

圖1 BALB/c和DBA2小鼠感染P.y17XL后的原蟲血癥水平(A)和生存率(B)Fig.1 Parasitaemia(A)and survival rate(B)of BALB/c and DBA2 mice infected with P.y17XL

圖2 BALB/c和DBA2小鼠感染P.y17XL后脾組織中IFN-γ mRNA(A)和IL-10 mRNA(B)的水平Fig.2 The mRNA level of IFN-γ (A)and IL-10(B)in the spleens of BALB/c and DBA2 mice infected with P.y17XL

2.3 BALB/c和DBA2小鼠感染P.y17XL后T細(xì)胞、B細(xì)胞表面Tim-1分子表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化

BALB/c小鼠感染 P.y17XL后第3天、第5天，脾細(xì)胞中 CD4+Tim-1+和CD19+Tim-1+細(xì)胞百分比均較未感染小鼠顯著上升(P﹤0.05)，但是，DBA2小鼠脾 CD4+Tim-1+和 CD19+Tim-1+細(xì)胞百分比在感染前后未見顯著變化(圖3)。在BALB/c和DBA2小鼠中，CD19+Tim-1+細(xì)胞占脾細(xì)胞的百分比均高于CD4+Tim-1+細(xì)胞所占百分比，CD19+Tim-1+細(xì)胞數(shù)量約為CD4+Tim-1+細(xì)胞數(shù)量的2～3倍(數(shù)據(jù)未顯示)。

2.4 P.y17XL感染的BALB/c和DBA2小鼠脾中Tim-1 mRNA水平的動(dòng)態(tài)變化

P.y17XL感染后，BALB/c和 DBA2小鼠脾組織中Tim-1 mRNA水平逐漸下降，感染后5 d，BALB/c和DBA2小鼠脾組織中Tim-1 mRNA水平均顯著低于未感染小鼠(P﹤0.05)，與脾T、B細(xì)胞表面Tim-1分子表達(dá)情況并不一致。但是，P.y17XL感染后3 d，DBA2小鼠Tim-1 mRNA水平顯著低于DBA/2小鼠(P﹤0.01)。

圖3 BALB/c(A)和DBA2(B)小鼠感染P.y17XL后脾細(xì)胞中CD4+Tim-1+和CD19+Tim-1+細(xì)胞的百分比Fig.3 The percentage of CD4+Tim-1+cells and CD19+Tim-1+cells in the splenocytes of BALB/c(A)and DBA2(B)mice infected with P.y17XL

圖4 BALB/c和DBA2小鼠感染P.y17XL后脾組織中Tim-1 mRNA的水平Fig.4 The mRNA level of Tim-1 in the spleens of BALB/c and DBA2 mice infected with P.y17XL

3 討論

本文探討了鼠瘧模型中淋巴細(xì)胞表面Tim-1分子表達(dá)與細(xì)胞因子分泌譜和感染結(jié)局的關(guān)系。結(jié)果顯示:對(duì)P.y17XL易感的BALB/c小鼠在感染過程中產(chǎn)生高水平的Th2型細(xì)胞因子IL-10，脾T、B淋巴細(xì)胞中Tim-1+細(xì)胞百分比在感染過程中顯著上升;而對(duì)P.y17XL抵抗的DBA2小鼠在感染過程中產(chǎn)生高水平的Th1型細(xì)胞因子IFN-γ，其脾T、B淋巴細(xì)胞中Tim-1+細(xì)胞百分比無顯著變化。提示具有調(diào)控 Th1/Th2極化功能的Tim-1分子可能參與抗瘧疾免疫應(yīng)答的調(diào)控。

Tim-1分子最初被發(fā)現(xiàn)表達(dá)在 CD4+T細(xì)胞［11］，而后，在肥大細(xì)胞、B 細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞表面都發(fā)現(xiàn)有Tim-1分子表達(dá)［1-4］。結(jié)果顯示，在小鼠脾細(xì)胞淋巴細(xì)胞中，Tim-1主要表達(dá)在B細(xì)胞表面而非T細(xì)胞上，與Rothstein等［5］的報(bào)道一致。本課題研究還顯示，BALB/c小鼠感染過程中，Tim-1+B細(xì)胞百分比逐漸上升，由于大部分調(diào)節(jié)性B細(xì)胞表達(dá)Tim-1 分子［5］，本研究推測(cè)，P.y17XL 感染的 BALB/c小鼠中，Tim-1+調(diào)節(jié)性B細(xì)胞可能被活化，并參與抑制 Th1應(yīng)答。BALB/c小鼠Tim-1分子與DBA2小鼠比較，有較長(zhǎng)的黏蛋白區(qū)，該區(qū)域?qū)τ谡{(diào)節(jié)性B細(xì)胞的抑制功能有重要作用［6，12］。研究中發(fā)現(xiàn)，DBA2小鼠感染過程中，Tim-1+T、B細(xì)胞百分比沒有出現(xiàn)明顯變化，可能與其Tim-1分子黏蛋白區(qū)域缺失導(dǎo)致Tim-1信號(hào)缺陷有關(guān)。另外，P.y17XL感染過程中，雖然BALB/c小鼠脾中Tim-1+T、B細(xì)胞百分比在感染過程中逐漸上升，且脾細(xì)胞總數(shù)也有明顯升高，但BALB/c和DBA2小鼠脾組織中Tim-1 mRNA水平卻逐漸下降。這種mRNA水平和細(xì)胞水平Tim-1分子表達(dá)差異的原因尚不清楚，可能存在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制;或Tim-1分子在其他類型細(xì)胞中的表達(dá)下降，導(dǎo)致脾組織中Tim-1 mRNA總體水平降低。

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