蓋磊 寧顯忠

胃癌嚴重威脅著人類的健康，但發(fā)病機制不清，仍無有效治療手段。端粒-端粒酶體系在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，端粒酶的激活導致了端粒的延長，而端粒的延長則促進了腫瘤的永生化，但仍有10%的腫瘤細胞端粒酶無活性增高表現(xiàn)［1］。疊氮脫氧胸苷(3-azido-deoxythymidine，AZT)可抑制端粒酶活性，進而阻止端粒的延長，從而抑制腫瘤的永生化。因此，本實驗擬利用AZT探討端粒酶活性對胃癌細胞株SGC7901存活率的影響，探討端粒-端粒酶體系在SGC7901細胞增殖分化中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料及儀器 SGC7901胃癌細胞株(中科院上海細胞庫)，DMEM高糖培養(yǎng)基及胎牛血清(Gibco公司)，AZT(sigma公司)，甲基噻唑基四唑(MTT，南京建成生物工程研究所)，TRAP-ELISA端粒酶活性試劑盒(Roche公司)，酶標儀(北京普郎克公司)。

1.2 實驗分組 SGC7901細胞株以1×104/孔的密度鋪于96孔板，細胞貼壁后分組培養(yǎng)，對照組(MDEM培養(yǎng)基+10%胎牛血清)，AZT-4、AZT-8及 AZT-16組分別添加 AZT 4、8及16 mmol/L，通過MTT實驗確定AZT抑制SGC7901細胞增殖的最佳濃度及時間，再利用TRAP-ELISA法檢測該條件下AZT對SGC7901細胞端粒酶活性的影響。

1.3 MTT法檢測SGC7901細胞存活率 分組培養(yǎng)24 h、48 h及72 h后，以無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)4 h，每孔分別加入20 μl MTT(5 mg/ml)，孵育 4 h后棄去培養(yǎng)液，加入 150 μl二甲基亞砜振蕩15 min，以酶標儀檢測吸光度(A值)，根據(jù)公式計算細胞活力:檢測組A值/對照組A值×100%。

1.4 TRAP-ELISA法檢測端粒酶活性 根據(jù)MTT實驗結(jié)果，檢測最佳抑制時間各組SGC7901細胞端粒酶活性。收集細胞，根據(jù)試劑盒說明建立 PCR反應體系，以 Ct值(cycle threshold)判斷端粒酶活性值，Ct值小表示模板數(shù)大，端粒酶活性高，根據(jù)公式計算端粒酶活性下調(diào)率=(實驗組平均Ct值-對照組平均Ct值)/對照組平均Ct值×100%。

2 結(jié)果

2.1 AZT對SGC7901細胞活力的影響 MTT實驗顯示，AZT可抑制SGC7901細胞活力，具有明顯的時間依賴性及劑量依賴性，其中AZT作用72 h對SGC7901細胞存活率影響最為顯著，因此本研究檢測了72 h后各組細胞端粒酶活性(表1)。

2.2 AZT對SGC7901端粒酶活性的影響 TRAP-ELISA法檢測顯示，AZT濃度越高，SGC7901細胞端粒酶活性越低(表2)。

表1 AZT對SGC7901細胞活力的影響(n=6/組)

表2 AZT對SGC7901細胞端粒酶活性的影響(n=6/組)

3 討論

端粒-端粒酶體系與腫瘤的增殖關(guān)系密切，該體系的激活具有促進腫瘤細胞增殖的作用。端粒是位于真核細胞染色體末端的核酸-蛋白復合體，可防止染色體DNA降解、缺失、末端融合以及非常規(guī)重組等，具有維持染色體結(jié)構(gòu)和功能的完整性及穩(wěn)定性等作用，與腫瘤的發(fā)生及凋亡密切相關(guān)［2］。端粒酶是一種核酸蛋白酶，屬逆轉(zhuǎn)錄酶，能以自身的RNA為模板合成端粒DNA序列，使端粒延長，是維持端粒穩(wěn)定的重要因素。端粒酶激活、端粒延長與腫瘤的發(fā)生關(guān)系密切，端粒酶活性高的腫瘤細胞易發(fā)生耐藥性［3］，抑制端粒-端粒酶活性已成為抑制腫瘤增殖的研究的熱點。

AZT是逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑，可與端粒酶這一逆轉(zhuǎn)錄酶結(jié)合，抑制端粒酶活性。本研究顯示，不同濃度AZT均可抑制SGC7901細胞端粒酶活性，并明顯抑制腫瘤細胞增殖，且AZT濃度越高，端粒酶活性越低，細胞存活率越低，提示端粒酶-端粒體系的活化是SGC7901細胞增殖的重要機制之一。盡管目前針對端粒酶的抑癌治療策略尚不完善，對機體的毒副作用尚不完全清楚，尚難用于臨床治療。但隨著對端粒-端粒酶在胃癌發(fā)病中研究的深入，端粒-端粒酶體系有望成為胃癌治療新的突破口。

［1］Theimer CA，F(xiàn)eigon J.Structure and function of telomerase RNA.Curr Opin Struct Biol，2006，16(3):307-318.

［2］Matsutani N，Yokozaki H，Tahara E，et al.Expression of telomeric repeat binding factor 1 and 2 and TRF1-interacting nuclear protein 2 in human gastric carcinomas.Int J Oncol，2001，19(3):507-512.

［3］Guan JZ，Guan WP，Maeda T，et al.Different levels of hypoxia regulate telomere length and telomerase activity.Aging Clin Exp Res，2012，24(3):213-217.