姜健 秦書儉

了解ADSCs的體外生長規(guī)律、生物學(xué)特性及成骨誘導(dǎo)分化能力的各種參數(shù)，已經(jīng)成為目前急需解決的問題。本研究通過探討ADSCs的生長增殖活性以及成骨分化能力，為ADSCs是否可以成為理想的種子細(xì)胞以及進(jìn)一步基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象 健康SD大鼠，由遼寧醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2 方法

1.2.1 ADSCs分離及原代、傳代培養(yǎng) 取SD大鼠，無菌條件下取腹股溝部脂肪組織，常規(guī)方法沉淀用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基制成單細(xì)胞懸液，置37℃、5%CO2、飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。原代培養(yǎng)每3 d換液。待細(xì)胞生長達(dá)到80%時(shí)，進(jìn)行1∶2傳代，繼續(xù)培養(yǎng)傳代。

1.2.2 貼壁細(xì)胞鑒定 取第2代的ADSCs，按照試劑盒說明進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色，分為4份，分別滴加兔抗鼠CD34、CD44、CD49 d、CD106一抗。用SABC顯色試劑盒顯色，倒置顯微鏡下觀察拍照。

1.3 成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)及指標(biāo)檢測 取第3代細(xì)胞，分別以1×104/mL的密度接種于24孔培養(yǎng)板、5×104/mL的密度接種到放有蓋玻片的6孔培養(yǎng)板中，更換為含有0.1 μmol/L地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸鈉、50 μmol/L 抗壞血酸的成骨誘導(dǎo)劑的DMEM培養(yǎng)基，每3 d換液。以加入不含誘導(dǎo)劑培養(yǎng)基的3代細(xì)胞作為對(duì)照組。

1.3.1 形態(tài)學(xué)觀察 每日在顯微鏡下觀察誘導(dǎo)后細(xì)胞的生長情況以及形態(tài)特點(diǎn)。

1.3.2 茜素紅染色礦化結(jié)節(jié)計(jì)數(shù) 取成骨誘導(dǎo)21 d的細(xì)胞，0.1%茜素紅染色30 min，鏡下觀察照相。將每孔均分為4個(gè)象限，每個(gè)象限隨機(jī)取一低倍2個(gè)視野，取8視野計(jì)數(shù)均值。

2 結(jié)果

2.1 貼壁細(xì)胞鑒定 對(duì)第2代貼壁細(xì)胞通過免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測了CD34、CD44、CD49 d、CD106四個(gè)細(xì)胞表面標(biāo)記，結(jié)果顯示貼壁細(xì)胞CD44、CD49 d陽性表達(dá)，細(xì)胞胞漿呈現(xiàn)棕黃色;而CD34、CD106為陰性表達(dá)，大部分細(xì)胞胞漿未著色，細(xì)胞核藍(lán)染。說明貼壁細(xì)胞為ADSCs，而非造血干細(xì)胞和BMSCs。

2.2 成骨能力檢測結(jié)果

2.2.1 形態(tài)學(xué)觀察 細(xì)胞在成骨誘導(dǎo)后，生長速度明顯變慢，細(xì)胞形態(tài)變化相似，逐漸由梭形變?yōu)榱⒎叫?、三角形、多角形，有?shù)個(gè)突起。

2.2.2 礦化結(jié)節(jié)染色 成骨誘導(dǎo)21 d，細(xì)胞鈣結(jié)節(jié)形成明顯，經(jīng)茜素紅染色出現(xiàn)紅色結(jié)節(jié)的陽性染色(圖1)，不加誘導(dǎo)劑的對(duì)照組染色為陰性(圖2)。

圖1 礦化結(jié)節(jié)陽性染色(×100)

圖2 對(duì)照組礦化結(jié)節(jié)染色陰性(×100)

3 討論

本實(shí)驗(yàn)中從脂肪組織獲取的單個(gè)核細(xì)胞，經(jīng)過貼壁培養(yǎng)，貼壁細(xì)胞表面表達(dá)CD44、CD49 d陽性;而CD34、CD106為陰性表達(dá)。CD34作為造血干細(xì)胞標(biāo)志性免疫表型，CD34陰性說明貼壁細(xì)胞并非來源于血液循環(huán)中的干細(xì)胞［1］，同時(shí)說明細(xì)胞未受到脂肪組織中微血管內(nèi)皮細(xì)胞的污染;有研究顯示ADSCs與 BMSCs都可表達(dá) CD44［2］;CD49 d在 ADSCs中為陽性表達(dá)，在BMSCs中則為陰性表達(dá);而與CD106則相反;本實(shí)驗(yàn)CD106陰性表達(dá)，已經(jīng)排除BMSCs污染的可能。以上結(jié)論說明已經(jīng)得到純度較高的ADSCs。CD49 d是調(diào)節(jié)造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞定居歸巢到骨髓的表面分子，CD106是調(diào)節(jié)造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞從骨髓中向外遷移的表面分子，CD49 d與CD106是ADSCs與BMSCs很好的區(qū)別標(biāo)記［3］，但其本質(zhì)有待進(jìn)一步的研究。

礦化結(jié)節(jié)是體外培養(yǎng)條件下成骨細(xì)胞鑒定的一個(gè)重要指標(biāo)，也是直接反應(yīng)干細(xì)胞成骨分化能力的一項(xiàng)指標(biāo)。ADSCs誘導(dǎo)21 d后經(jīng)茜素紅鈣結(jié)節(jié)染色，均出現(xiàn)紅色結(jié)節(jié)的陽性表達(dá)。

［1］Civin CI，Banquerigo ML，Strauss LC，et al.Antigenic analysis of hematopoiesis.VI.Flow cytometric characterization of My-10-positive progenitor cells in normal human bone marrow.Exp Hematol，1987，15(1):10-17.

［2］Katz AJ，Tholpady A，Tholpady SS，et al.Cell surface and transcriptional characterization of human adipose-derived adherent stromal(hADAS)cells.Stem Cells，2005，23(3):412-423.

［3］Gronthos S，F(xiàn)ranklin DM，Leddy HA，et al.Surface protein characterization of human adipose tissue-derived stromal cells.J Cell Physiol，2001，189(1):54-63.