楊曉龍 李德華 李洪秀

隨著生活節(jié)奏的加快，各種原因?qū)е碌墓墙M織損傷、缺損患者越來越多。目前臨床治療骨損傷的骨板、骨釘及植骨材料主要是不銹鋼、鈦合金及聚乳酸等。但這些材料不能降解需要二次手術(shù)取出，并且組織相容性差［1］。因此尋找力學(xué)性能好、組織相容性強(qiáng)，又可安全降解的新型骨組織工程支架材料意義重大。

最新發(fā)現(xiàn)表明鎂合金具有良好的力學(xué)特性及人工可降解性，有望成為新型植骨材料，應(yīng)用于骨損傷的固定及組織工程骨的支架材料［2］。但鎂合金與細(xì)胞的生物相容性尚待探討，其能否利于成骨細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖分化尚無定論。因此，本研究擬將骨髓干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為成骨樣細(xì)胞，并在體外與鎂合金材料復(fù)合培養(yǎng)，檢測(cè)成骨樣細(xì)胞的形態(tài)、增殖能力及成骨分化情況，為鎂合金的體外細(xì)胞相容性提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，為其能成為新型骨修復(fù)材料提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康清潔級(jí)SD大鼠20只，體質(zhì)量100～150 g，雌雄不限，由遼寧醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 主要試劑 L-DMEM、H-DMEM、胎牛血清(Gibco)，胰蛋白酶、β-甘油磷酸鈉(Sigma)，堿性磷酸酶染色試劑盒、ALP活度檢測(cè)試劑盒(凱基生物)。

1.3 大鼠BMSCs的原代培養(yǎng)及向成骨樣細(xì)胞分化 大鼠行頸椎離斷法處死，無菌分離雙側(cè)股骨，含10%FBS的L-DMEM沖洗骨髓腔，接種至50 ml培養(yǎng)瓶中。37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)。每3 d換液，達(dá)80%融合時(shí)傳代培養(yǎng)。

取P3的BMSCs，以0.5×105/孔的細(xì)胞懸液接種于鋪有蓋玻片的六孔板。待細(xì)胞達(dá)90%融合時(shí)更換成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液(含10%FBS的H-DMEM、10 mmol/L的β-甘油磷酸鈉、10-7 mol/L地塞米松、5 mg/L抗壞血酸)。37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)，每3 d換液。

1.4 堿性磷酸酶(ALP)染色鑒定誘導(dǎo)后的成骨樣細(xì)胞 當(dāng)誘導(dǎo)后細(xì)胞達(dá)90%融合時(shí)，4%多聚甲醛固定，PBS漂洗。堿性磷酸酶染色(按試劑盒說明進(jìn)行)，封片，光學(xué)顯微鏡觀察。

1.5 可降解鎂合金材料樣品的制備 將鎂合金(重量百分比:Zn 1.2%，Mn 0.6%，Ca 2.0%)支架材料用PBS清洗并吹干，置于24孔培養(yǎng)板，紫外線照射消毒正反面各2 h，備用。

1.6 成骨樣細(xì)胞與鎂合金材料的復(fù)合培養(yǎng) 消化制備2×105/ml的成骨樣細(xì)胞懸液，接種到置于24孔培養(yǎng)板中的鎂合金支架材料表面，孵箱內(nèi)復(fù)合培養(yǎng)。24 h、48 h、72 h后行戊二醛固定，洗滌，脫水，CO2臨界點(diǎn)干燥、噴金后，掃描電子顯微鏡細(xì)胞形態(tài)。

1.7 制備鎂合金支架材料浸提液 無菌條件下，按照材料表面積/浸提介質(zhì)為0.003 cm2/L的比例，加入成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液至盛有鎂合金支架材料的容器中。孵箱中孵育24 h后提取容器中的液體，即為浸提液，應(yīng)用此浸提液進(jìn)一步培養(yǎng)成骨樣細(xì)胞。

1.8 MTT法檢測(cè)浸提液培養(yǎng)的成骨樣細(xì)胞增殖活性 消化制備1×104/ml的成骨樣細(xì)胞懸液，接種至96孔板，培養(yǎng)24 h后，將培養(yǎng)液換為浸提液，對(duì)照組加入普通的成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液，分別培養(yǎng) 12 h、24 h、48 h、72 h 后，每孔加入 20 μl MTT(5 mg/ml)，37℃孵育 4 h，每孔加 DMSO 150 μl，震蕩，用酶聯(lián)免疫儀選擇570nm波長(zhǎng)測(cè)定各孔的光吸收值。

1.9 檢測(cè)浸提液培養(yǎng)的成骨樣細(xì)胞ALP活度 消化制備1×105/ml的成骨樣細(xì)胞懸液，接種至6孔板，培養(yǎng)24 h后，將培養(yǎng)液換為浸提液，對(duì)照組加入普通的成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液，分別培養(yǎng)12 h、24 h、48 h、72 h后，胰酶消化制成單細(xì)胞懸液，超聲粉碎細(xì)胞，按ALP活度檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行堿性磷酸酶活度的檢測(cè)。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用SPSS 13.0軟件，采用One-way ANOVA進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。P＜0.05為有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 骨髓干細(xì)胞分化為成骨樣細(xì)胞的形態(tài)觀察及鑒定 原代培養(yǎng)的骨髓干細(xì)胞逐漸伸展成長(zhǎng)梭形，類似成纖維細(xì)胞，呈渦輪狀緊密排列(圖1)。加入成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液后，逐漸變成多角形，具有成骨細(xì)胞的形態(tài)特點(diǎn)，并聚集形成鈣化結(jié)節(jié)(圖2)。堿性磷酸酶染色顯示成骨誘導(dǎo)后的細(xì)胞含有大量ALP，呈深棕黑色陽(yáng)性表達(dá)(圖3)。證實(shí)骨髓干細(xì)胞經(jīng)成骨誘導(dǎo)后可分化為成骨樣細(xì)胞，具有成骨細(xì)胞的形態(tài)和特性。

圖1 原代培養(yǎng)的骨髓干細(xì)胞(相差顯微鏡×100)

圖2 骨髓干細(xì)胞誘導(dǎo)分化的成骨樣細(xì)胞(相差顯微鏡×100)

圖3 成骨樣細(xì)胞的堿性磷酸酶染色(光鏡×100)

2.2 掃描電鏡觀察 成骨樣細(xì)胞黏附在較粗糙的材料表面，伸展成短梭形或多角形，并伸出突起，形成細(xì)胞連接，生長(zhǎng)狀態(tài)良好，增殖旺盛(圖4)。表明支架材料具有明顯的細(xì)胞相容性，適合細(xì)胞黏附生長(zhǎng)。

圖4 成骨樣細(xì)胞與支架材料復(fù)合培養(yǎng)(掃描電鏡×100)

2.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性 結(jié)果顯示隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，兩組的吸光度都逐漸增高(P＜0.05)，表明浸提液與普通成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液均可保證成骨樣細(xì)胞正常生長(zhǎng)，經(jīng)歷了潛伏期和對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。而在相同時(shí)間點(diǎn)兩組的吸光度并未有明顯差異(P＞0.05)，表明浸提液培養(yǎng)的成骨樣細(xì)胞具有正常的增殖活性，并未受到抑制，浸提液沒有明顯的細(xì)胞毒性(圖5)。

圖5 成骨樣細(xì)胞的MTT值

2.4 ALP活度檢測(cè) 結(jié)果顯示隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，兩組的細(xì)胞的ALP活度都逐漸增高(P＜0.05)，表明浸提液與普通成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液一樣可以促進(jìn)成骨樣細(xì)胞分泌堿性磷酸酶。而在相同時(shí)間點(diǎn)兩組的ALP活度并未有明顯差異(P＞0.05)，表明浸提液培養(yǎng)的成骨樣細(xì)胞可以維持其正常的成骨活性(圖6)。

圖6 成骨樣細(xì)胞的ALP活度值

3 討論

Friedenstein等［3］發(fā)現(xiàn)骨髓干細(xì)胞在一定條件下可分化為成骨細(xì)胞，表達(dá)成骨細(xì)胞表型，骨髓干細(xì)胞成功活躍在骨組織工程領(lǐng)域。本研究采用全血培養(yǎng)法分離SD大鼠股骨骨髓，培養(yǎng)的骨髓干細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，增殖能力強(qiáng)，具有間充質(zhì)干細(xì)胞的特性。在成骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)下骨髓干細(xì)胞變?yōu)槎嘟切尾⑿纬赦}結(jié)節(jié)，經(jīng)堿性磷酸酶染色發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)后的細(xì)胞呈深棕色陽(yáng)性表達(dá)，我們認(rèn)為其具有成骨細(xì)胞的形態(tài)及生物學(xué)特性，可以稱為成骨樣細(xì)胞，符合成骨細(xì)胞分泌有機(jī)成分和礦物質(zhì)的鑒定指標(biāo)［4］。

支架材料是組織工程領(lǐng)域的三大要素之一，必須具備良好的組織相容性和可降解性，促進(jìn)細(xì)胞的黏附和生長(zhǎng)。作為骨組織工程的支架材料還要富于一定的韌性和硬度，因此近年來鎂合金作為可降解的新型骨組織工程支架材料備受關(guān)注［5］。其具有高分子化合物獨(dú)特的可降解性，又兼有金屬材料的堅(jiān)韌性。數(shù)據(jù)表明高強(qiáng)度鎂合金的比強(qiáng)度可以達(dá)到480 gPa/(g/cm3)，密度約為1.7 g/cm3，與人的骨密度(1.75 g/cm3)較接近，符合理想的骨板要求;鎂合金的彈性模量是45 gPa，而人骨彈性模量為 20 gPa，足以滿足人植骨的要求［6］。大量研究又表明作為骨固定材料鎂合金可以加速損傷骨質(zhì)愈合，抑制局部骨質(zhì)疏松的發(fā)生［7，8］。

目前對(duì)于支架材料的評(píng)價(jià)包括體內(nèi)和體外兩種。體外實(shí)驗(yàn)是將細(xì)胞或組織與支架材料或支架浸提液復(fù)合培養(yǎng)，檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖及功能等相關(guān)指標(biāo)，比體內(nèi)實(shí)驗(yàn)更具有可控性、可重復(fù)性、可定量分析等優(yōu)點(diǎn)［9］，是評(píng)價(jià)支架材料組織相容性的重要依據(jù)。因此本研究將誘導(dǎo)成功后的成骨樣細(xì)胞與鎂合金復(fù)合培養(yǎng)，經(jīng)掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)材料表面有大量細(xì)胞附著，生長(zhǎng)狀態(tài)良好，表明此支架材料有利于成骨樣細(xì)胞的黏附生長(zhǎng)。檢測(cè)浸提液培養(yǎng)下細(xì)胞的增殖活性，有助于考察支架材料的毒性［10］。MTT法操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、重復(fù)性好是檢測(cè)細(xì)胞增殖活性的主要方法。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明經(jīng)浸提液培養(yǎng)的成骨樣細(xì)胞仍具有旺盛的增殖潛能，說明鎂合金支架材料不具有細(xì)胞毒性。本實(shí)驗(yàn)又應(yīng)用ALP活度檢測(cè)試劑盒檢測(cè)浸提液培養(yǎng)細(xì)胞的成骨分化情況，發(fā)現(xiàn)浸提液培養(yǎng)的細(xì)胞與正常培養(yǎng)液組的堿性磷酸酶活度并未出現(xiàn)明顯差異，說明鎂合金材料的浸提液與正常成骨誘導(dǎo)液一樣，也可以促進(jìn)成骨樣細(xì)胞的成骨分化，具有明顯的骨誘導(dǎo)能力。

本實(shí)驗(yàn)探討了鎂合金材料在體外促進(jìn)成骨樣細(xì)胞的增殖和分化情況，但關(guān)于鎂合金植骨材料在動(dòng)物體內(nèi)組織中能否促進(jìn)骨組織再生，有待于后續(xù)的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行證實(shí)。

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