張奇龍 徐 紅 王 麗 肖 竦

（貴陽醫(yī)學(xué)院化學(xué)教研室,貴州貴陽550004）

光石韋為水龍骨科蕨類植物光石韋Pyrrosia calvata(Bak.)Ching的全草，別名大肺癆草。具有清熱、利尿、止咳、止血的功效，主治：肺熱咳嗽、痰中帶血、小便不利、熱淋、沙淋、頸淋巴結(jié)核、燒燙傷、外傷出血[1,2]。石韋屬植物含有黃酮類化合物[3]。研究表明，黃酮類化合物具有抗過敏、降血壓、抗炎、抗菌、抗突變、抗?jié)?、抗病毒、保肝和降血脂等活性[4]。鑒于黃酮類化合物具有多種生理活性，對(duì)黃酮的研究具有重要的意義。不同種的石韋中總黃酮及其它有效成份的含量可能存在差異，這會(huì)導(dǎo)致不同種石韋在藥用功效上的不同，通過對(duì)這些物質(zhì)的測(cè)定，可對(duì)藥材的品質(zhì)進(jìn)行評(píng)價(jià)[5]。已有文獻(xiàn)報(bào)道對(duì)石韋、氈毛石韋、華北石韋、有柄石韋、廬山石韋中的總黃酮進(jìn)行提取和含量測(cè)定[6,7]。但是，對(duì)光石韋中總黃酮含量的提取和測(cè)定未見文獻(xiàn)報(bào)道。我們對(duì)光石韋中總黃酮的提取工藝及含量測(cè)定進(jìn)行研究，為光石韋的有效利用提供參考。本實(shí)驗(yàn)采用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)探究光石韋總黃酮的提取工藝，以蘆丁為對(duì)照品，用紫外分光光度法測(cè)定總黃酮含量。

1 儀器與材料

1.1 儀器:UV-2401型分光光度計(jì) (日本島津)，BS210S型萬分之一電子天平 (北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)；SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司)，RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 (上海亞榮生化儀器廠)，DF-101S數(shù)控集熱式磁力攪拌器 (杰瑞爾電器有限公司)，HH-S數(shù)顯恒溫水浴鍋(江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠)。

1.2 材料:光石韋 (Pyrrosia calvata(Bak.)Ching)藥材采自貴州省安順市紫云縣候場(chǎng)鎮(zhèn)，經(jīng)貴陽中醫(yī)學(xué)院趙俊華教授鑒定為光石韋。無水乙醇、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁、石油醚(試劑為分析純)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 總黃酮的測(cè)定方法

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備：精密稱取蘆丁標(biāo)品 (干燥)20 mg，置于70%微熱乙醇中超聲溶解，定容至 200 mL，搖勻，得濃度為0.1 mg·mL-1的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.1.2 吸收波長(zhǎng)的選擇：根據(jù)文獻(xiàn)方法[8]精密量取蘆丁對(duì)照品液5.0 ml至25 ml容量瓶中，加5%NaNO2溶液0.3 mL，搖勻，放置 6 min，加 10%Al(NO3)3溶液 0.3 mL，搖勻，放置 6 min，加 1 mol/L NaOH溶液 4 mL，加70%乙醇 0.4 mL，搖勻，放置 15 min，置于比色皿中，在波長(zhǎng)400～600 nm之間測(cè)定吸光度，結(jié)果最大吸收波長(zhǎng)在510 nm。

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：分別精密吸取上述蘆丁標(biāo)準(zhǔn)0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL于 6只 15 mL具 塞 試 管中，分別加 70%乙醇至 5 ml，加 5%NaNO2溶液 0.3 mL，搖勻，放置 6 min，加 10%Al(NO3)3溶液 0.3 mL，搖勻，放置 6 min，加 1 mol/L NaOH溶液 4 mL，加 70%乙醇0.4 mL，搖勻，放置 15 min，于 510 nm波長(zhǎng)處以第一支試管溶液為空白對(duì)照，測(cè)定吸光度，結(jié)果見表1。以濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立回歸方程 A=11.238C-0.0022，r=0.99928。

表1 濃度與吸光度

2.1.4 光石韋中總黃酮的提取和含量測(cè)定：將光石韋洗凈，低溫烘干，用電動(dòng)植物粉碎機(jī)粉碎。稱取100 g于燒杯中,加入石油醚浸泡過夜脫脂去色，然后經(jīng)布氏漏斗抽濾，濾渣風(fēng)干，得脫脂去色的光石韋樣品，精確稱取脫脂去色的光石韋樣品9份，每份 5.0 g，按照三因素三水平實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)(見表2)的 9種提取方案，分別回流提取材料中的總黃酮，過濾收集濾液，將濾液減壓濃縮并回收乙醇，得浸膏。將浸膏在60℃下真空干燥，研碎后得光石韋總黃酮粗提物。精密稱取浸膏 10 mg，溶解，定容至 25 mL，精密量取 4 mL的供試品溶液，自“加 70%乙醇溶液至 5 mL……”同上，以 70%乙醇為空白試劑，在最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定各供試液的吸光度，并計(jì)算總黃酮含量。

2.1.5 精密度實(shí)驗(yàn)：稱取脫脂去色的光石韋樣品5.0 g，利用正交實(shí)驗(yàn)選取的最佳方案制備供試品溶液。測(cè)定方法同上，連續(xù)測(cè)定5次。計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD值為0.28%，表明該方法精密度良好 。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗(yàn):取供試品溶液，于 10、20、30、40、50、60 min時(shí)測(cè)定吸收值。計(jì)算 60 min內(nèi)吸光度的RSD值為 0.30%，表明吸光度在60 min中內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.7 重復(fù)性試驗(yàn):稱取脫脂去色的光石韋樣品 6份，每份5.0 g，按正交試驗(yàn)優(yōu)選的提取工藝進(jìn)行提取，再按“2.1.4樣品含量測(cè)定”項(xiàng)進(jìn)行分析，計(jì)算樣品中總黃酮含量的 RSD值為 2.10%(n=6)，表明重復(fù)性良好。

2.1.8 回收率實(shí)驗(yàn):精密稱取已知總黃酮含量的光石韋樣品 6份，每份5.0 g，加入適量標(biāo)準(zhǔn)品，按正交試驗(yàn)優(yōu)選的提取工藝進(jìn)行提取，再按“2.1.4樣品含量測(cè)定”項(xiàng)進(jìn)行測(cè)定，經(jīng)計(jì)算得平均回收率為 99.00%，RSD值為2.20%，表明回收率良好。

2.2 提取工藝的優(yōu)選

2.2.1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)：為了系統(tǒng)考察乙醇提取法的條件參數(shù)，確定乙醇提取光石韋中黃酮的最佳工藝條件，我們選擇以總黃酮得率為考察指標(biāo)，將各考察因素取3個(gè)水平進(jìn)行了L9(34)正交試驗(yàn)，以考察乙醇濃度、料液比、提取次數(shù)、提取時(shí)間對(duì)總黃酮得率的影響。因素水平表見表2。

表2 因素水平表

總黃酮提取正交實(shí)驗(yàn)的結(jié)果與分析見表3。由表3中極差分析可知，各因素依次為A>B>C>D，以A2B2C2D1最佳。

2.2.2 工藝的驗(yàn)證試驗(yàn):精密稱取脫脂去色的光石韋樣品 3份，每份5.0 g。按上述正交試驗(yàn)優(yōu)選的提取工藝進(jìn)行提取，再按“2.1.4樣品含量測(cè)定”項(xiàng)下進(jìn)行分析，計(jì)算總黃酮含量得光石韋中總黃酮的平均含量為6.803%，RSD值為 1.72%(見表4)。

表3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

表4 工藝驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

3 討 論

黃酮類化合物是一大類天然產(chǎn)物，是石韋等許多中草藥的有效成分，具有抗腫瘤、抗心腦血管疾病、抑菌抗病毒、抗氧化、抗衰老、抗輻射等功效[9]。如何利用有限的光石韋資源，得到最高的黃酮產(chǎn)量是很有意義的。本文根據(jù)正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)從光石韋中提取總黃酮，其優(yōu)選的最佳工藝條件為：料液比為1:20的55%乙醇，回流提取2次，每次2 h。測(cè)得光石韋中總黃酮的平均含量為6.803%。比文獻(xiàn)報(bào)道的廬山石韋[7]，石韋[6]中的總黃酮含量高。不同種石韋總黃酮含量存在顯著差別，而總黃酮含量的巨大差別啟示不同種石韋可能具有不同的藥用功效，相關(guān)的工作值得進(jìn)一步研究。

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